皮肤定居记忆CD4+T细胞在天疱疮皮损形成中的机制研究

Pemphigus is a typical model of organ-specific autoimmune disease and its classical theory of pathogenesis is recognized as the occurrence of circulating specific anti-Dsg IgG autoantibodies which cause the blistering disorder. But in pemphigus patients, more lesions occur on the head, face, chest and back. And lesions in these areas are more likely to recur. In addition, some of the lesions can be controlled by topical treatment only, which can not completely explained by the classical theory. In recent years, the newly discovered skin resident memory T cells (TRM) are recognized as important cells in adaptive immune response, which lead to autoimmune diseases when the function of TRM is abnormal or some autoantigens expose. Activating signals from CD4+T cells are needed for B cell maturation and antibody production. IL-21 and IL-4 produced by CD4+T cells play a key role in the antibody secretion and isotype class switching. According to our previous data, B cells in pemphigus lesion are able to produce anti-Dsg IgG antibody，and the proportion of skin CD4+TRM was elevated in patients’lesion，which could produce significantly increased IL-21 and IL-4. In this study, we will focus on the role of skin CD4+TRM cells in B cell activation and antibody production and the underlying mechanism, further to investigate the new therapeutic targets.

天疱疮是器官特异性自身免疫病的典型，较公认的发病机制为循环中天疱疮抗体导致疾病的发生。但临床上皮损多好发于头面及胸背部，且这些部位更易于复发；部分皮损仅外用治疗就可控制，这用经典理论并不能完全解释。近年来新发现的皮肤定居记忆T细胞（TRM）是适应性免疫应答的重要细胞，当自身抗原暴露或TRM异常时可导致自身免疫病的发生。B细胞产生抗体需要CD4+T细胞辅助，其产生的IL-21、IL-4在抗体生成和亚型转化中发挥关键作用。我们前期研究发现皮损处存在CD4+TRM，且功能异常，分泌IL-21、IL-4显著增加；皮损处也存在活化B细胞，可产生天疱疮抗体。本课题拟在前期工作基础上从临床和实验两方面对皮肤CD4+TRM细胞及其效应分子促进皮肤B细胞局部产生天疱疮抗体的作用进行序贯性研究，阐明天疱疮皮损形成、复发的新机制；并通过免疫干预对其作用过程中的关键分子进行阻断，从而寻找疾病治疗的新靶点。

目的：天疱疮是器官特异性自身免疫病的典型，以往认为循环抗体发挥了致病作用，但很多临床现象无法用经典理论来解释。我们前期研究发现天疱疮皮损处存在可产生抗桥粒芯糖蛋白（Dsg）特异性自身抗体的B细胞。近年新发现的组织定居记忆T（tissue-resident memory T，TRM）细胞是适应性免疫应答的重要细胞。本研究从皮损局部 CD4+TRM 细胞的表型、活性、辅助B细胞产生抗Dsg抗体的能力及其可能的调控机制等方面进行研究，以更好地揭示天疱疮皮损发生的免疫机制。.方法：收集天疱疮患者，流式细胞术检测皮损CD4+TRM细胞的比例，分析其与临床特征的相关性；结合实时荧光定量PCR检测皮损处该细胞的表型、活性以及分泌细胞因子的能力；在皮损淋巴细胞体外培养中，加入IL-21或IL-21单抗，ELISA检测上清中抗Dsg抗体滴度，观察IL-21对其的影响；通过全转录组测序及生信分析，进一步挖掘该细胞与对照的差异表达基因，并通过慢病毒感染后沉默相关关键调控基因，观察对天疱疮抗Dsg抗体生产的影响。.结果：天疱疮皮损中CD4+TRM细胞比例较正常人显著增多；其比例与疾病PDAI评分和控制病情需要的激素剂量呈正相关。皮损 CD4+TRM 细胞表面存在显著增多的共刺激分子，如 CD28，CD38，CD40L，ICOS，HLA-DR和 PD-1等；分泌 IL-21/IL-17A 显著增多。将皮损中淋巴细胞体外培养，去除CD4+TRM细胞后产生抗Dsg抗体显著减少；且受IL-21的调节。全转录组测序发现皮损 CD4+TRM细胞显著高表达 PD-1、ICOS、CD40L、OX40等共刺激分子，是Tfh样细胞，表达IL-21显著上调；相关转录因子干扰素调节因子4（IRF4）和亮氨酸链装转录因子（BATF）显著上调；将CD4+TRM细胞IRF4基因沉默后，其分泌IL-21细胞因子的能力显著减少；辅助B细胞产生抗Dsg抗体显著减少。.结论：天疱疮患者皮损中CD4+TRM细胞是活化的Tfh样细胞，通过IL-21辅助皮损局部B细胞产生抗Dsg抗体，IRF4可能是IL-21的关键调节因子，它与CD4+TRM细胞的激活和致病性自身抗体的产生有关。这是对天疱疮经典的循环抗体致病理论的重要补充，为揭示天疱疮皮损局部免疫应答提供了理论依据。