DTMUV E/NS1蛋白N-糖基化位点对病毒复制和致病性的影响

Duck Tembusu virus (DTMUV) is a newly emerging pathogenic flavivirus that is causing massive economic loss in the Chinese duck industry. Previous reports have demonstrated that N-linked glycosylation play an important role in viral replication and pathogenicity. The envelope protein E and non-structural protein NS1 of DTMUV have one and three predicted N-linked glycosylation sites, respectively. However, little is known about the biological function of those predicted N-linked glycosylation sites of DTMUV. In this project, an DNA-launched (plasmid DNA transfection-based) reverse genetics system was developed for DTMUV by introduction of ribozyme elements at both termini of the viral genomic cDNA that were placed under the control of a CMV promoter. Then, the role of N-linked glycosylation sites of DTMUV E /NS1 protein in viral replication and pathogenesis was examined by eliminating potential sites using a reverse genetics system. This project will contribute to prevention and control of DTMUV.

鸭坦布苏病毒(DTMUV)是2010年在我国新出现的致病性黄病毒，给我国的鸭养殖业造成了巨大损失。先前的研究结果表明：糖基化对病毒的复制和致病具有重要作用。DTMUV的E和NS1蛋白分别有1和3个N-糖基化位点，但这些N-糖基化位点对DTMUV的复制和致病性的影响尚不明确。为了解E/NS1蛋白N-糖基化位点对DTMUV的生物学意义，本项目采用反向遗传操作技术、定点突变技术、细胞培养技术和实验动物技术等手段，拯救出一系列E/NS1蛋白N-糖基化位点突变的△-DTMUV和未突变的rDTMUV，通过细胞试验和动物试验研究这些病毒的复制情况和致病情况，阐明糖基化位点对DTMUV复制和致病性的影响，为DTMUV的防控提供理论依据。

鸭坦布苏病毒(DTMUV)是2010年在我国新出现的致病性黄病毒，给我国的鸭养殖业造成了巨大损失。本项目开展了如下工作：（1）从山东、江西、广东、广西等国内主要鸭养殖区收集国内主要鸭养殖区收集鸭坦布苏病疑似样品，进行病原分离鉴定，共新分离到鸭坦布苏病毒10株。（2）评价DTMUV SD株对雏鸭血清生化指标、细胞因子和病毒复制情况的影响，DTMUV对肝脏、肾脏、心脏和肌肉组织都有严重损伤；DTMUV可以在肝脏、脾脏、肺脏、脑中增殖，并于攻毒后第5天在肝脏和脑中达到高峰，于攻毒后第9天后在肺脏和脾脏中达到高峰，且脑、肝脏、脾脏中病毒含量最高； 攻毒后第1天DTMUV就可引起脾脏中IFN γ、IFN α、IL-6、IFN β、IL-1β、TLR-7、IL-2、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ细胞因子过渡表达，在脑中第1，2，3天均引起促炎性细胞因子IL-6、IL-2的过渡应答。（3）对DTMUV SD株进行了全基因组测定分析，构建了DTMUV反向遗传学操作技术平台，拯救了糖基化位点突变病毒。（4）探讨了RIG-I和MDA5介导的信号通路在抗DTMUV感染的作用。首先通过前期的实验，我们发现DTMUV能诱导RIG-I、MDA5、MAVS和IFN-β在mRNA水平上显著上调。进一步地，先在DEFs上分别过表达RIG-I和MDA5的全长及其效应结构域，再感染DTMUV，发现两个受体及其效应结构域均能抑制DTMUV增殖。继而，我们克隆并表达了鸭MAVS基因（duMAVS），通过过表达和RNA干扰证实，duMAVS在DTMUV感染过程中是必须的。此外，DTMUV感染后能进一步刺激RIG-I和MDA5诱导的转录因子NF-κB和IRF-7的产量，说明过表达的RIG-I和MDA5识别DTMUV核酸后能通过NF-κB和IRF-7信号通路激活下游IFN-β。（5）评价了18种藏药抗DTMUV的效果。岩生忍冬抗DTMUV的作用最好，杠板归和独一味阻断DTMUV与细胞的吸附作用最好；岩生忍冬抑制DTMUV的作用最好，纤毛婆婆纳和岩生忍冬对DTMUV的杀灭作用最好。以上研究为鸭坦布苏病毒的病原学研究提供了技术基础，为鸭坦布苏病毒的防控奠定了基础。