高粱褐色中脉基因bmr-6的图位克隆

高粱褐色中脉与传统白脉品种相比，其可消化纤维素和半纤维素含量增加，难以消化的木质素含量显著降低，利用褐色中脉突变体来改善饲用高粱及高粱-苏丹草杂交种品质已引起各国研究者的浓厚兴趣。本项目利用高粱bmr-6类型褐色中脉突变体与白脉苏丹草品种进行正反交，构建F2分离群体，根据高粱物理图谱和目标区域的序列设计并合成500对左右的引物，从而将目标基因定位在40kb以内。然后，利用高粱基因组序列设计PCR引物，构建目的区域重叠群，并对重叠群进行拼接和目标序列基因预测，通过BLAST分析，筛选出和木质素合成相关的基因。利用候选基因设计引物，进行RT-PCR的时空表达谱的初步验证。将侯选基因转入白脉高粱中，进行互补性功能验证。最后，确认候选基因的褐色中脉功能，为最终改良饲用高粱的草质以及其它牧草草质的分子改造提供理论基础。

高粱不仅是一种粮食作物，也是一种重要的饲料作物，因具有抗旱、耐涝、耐盐碱等特性，在世界各国广为栽培。褐色中脉（bmr）突变体的木质素含量明显低于野生型白脉品种，其可消化率得到极大提高。对于能源高粱，这种突变体更容易让消化酶进入到组织中，使乙醇转化效率显著提高。因此，褐色中脉基因的克隆对提高高粱、高粱-苏丹草杂交种等牧草品质及乙醇转化效率具有重要理论价值和应用前景。.本项目在高粱褐色中脉基因bmr-6的遗传分析以及初定位的基础上，扩大F2群体，将bmr-6基因精细定位在56.5Kb内，发现在CAD（Sb04g005950）基因的编码区测到一个碱基的差异，从C变为T。为了验证该突变基因即为目的基因，开展了bmr-6基因的遗传互补分析，发现CAD（Sb04g005950）基因即为bmr-6基因。将高粱bmr-6基因的蛋白序列与水稻、拟南芥和玉米的木质素合成CAD基因进行比较，表明bmr-6基因为木质素直接合成酶基因。为确定褐色中脉bmr-6蛋白在细胞哪个部位执行其功能，进行了该基因亚细胞定位，发现在细胞质中。分别取野生型根、茎、穗、叶、中脉部分提取RNA，设计bmr-6基因的荧光定量引物，开展褐色中脉bmr-6基因的表达模式和同源基因表达分析，构建了bmr-6基因的原核表达载体。通过对突变体bmr-6与野生型的表达谱分析，发现bmr-6基因的突变对于高粱的生长发育相关基因有重要影响。在12个参与木质素合成的差异表达酶基因中，除1个表达下调外，其余11个均表达上调。11个表达上调的基因启动子区都有1个到多个MYB转录因子结合位点。这说明木质素存在一条反馈调节的路径，这种反馈调节与MYB类型的转录因子有关。这一结果对于木质素生物合成途径调控研究以及木质素基因工程育种具有重要意义。.通过本项目的实施，发表相关研究论文9篇，其中SCI期刊1篇，CSCD 期刊4篇，学术会议论文1篇。获国际Eni奖提名1项，获中国草业科技奖三等奖1项，获安徽省级教学名师奖1项，获国家发明专利5项，获实用新型专利1项，选育新品种1个。项目组有2人获国家自然科学基金委青年科学基金项目资助，1人被遴选为安徽省学术和技术带头人。.综上所述，本项目已完成全部计划任务。