高粱褐色中脉基因bmr-6及其同源基因SbCAD-3和SbCAD-4的功能分析

Comparing to the wild type, the content of lignin significantly decreased in sorghum brown midrib mutant（bmr-6） and the digestibility of brown midrib was significantly improved.It is very important to improve the forage quality of sorghum. Sorghum brown midrib 6(bmr-6) encodes a cinnamyl alcohol dehydrogenase,which catalyzes the last step in the biosythesis of lignin subunits.The functional lost of a CAD gene usually was complemented by other CAD genes.It will confine the application of this gene in molecular breeding.So we should dissect the function of CAD genes which involves the biosynthesis of lignin.Our research identified that bmr-6,SbCAD-3 and SbCAD-4 maybe involve the biosynthesis of lignin.Therefore,we will try to dissect the function of bmr-6,SbCAD-3 and SbCAD-4 and their relationship in the biosynthesis of lignin by analyzing the temporal expression,subcelluar localization,enzyme assay and RNAi plants of the three genes.It will not only help to analyze the molecular mechanism of lignin biosynthesis in C4 plants, but also create the premise of improvement of the forage quality in sorghum.

高粱褐色中脉突变体bmr-6的木质素含量显著地低于其野生型，消化率得到较大提高，对于高粱的饲用品质的改良具有重要作用。高粱褐色中脉bmr-6编码了木质素合成途径上的肉桂醇脱氢酶基因（CAD），而单个CAD基因的缺失往往能够被CAD基因家族其它成员弥补，因而限制了其在分子育种中的应用。这就需要研究者解析参与木质素合成途径上的多个CAD基因的功能。本课题组前期研究发现bmr-6、SbCAD-3和SbCAD-4都可能参与到高粱木质素的生物合成中。因此，本研究将从bmr-6与SbCAD-3和SbCAD-4的时空表达、亚细胞定位、原核表达的酶活测定、RNAi干扰后代的生化分析等对bmr-6、SbCAD-3和SbCAD-4基因功能进行解析，试图从分子水平阐明它们在高粱木质素生物合成途径上的作用以及它们之间的关系。这对于解析CAD基因家族在高粱木质素合成途径上的作用及饲用品质育种具有重要的作用和意义。

高粱褐色中脉突变体bmr-6的木质素含量显著地低于其野生型，消化率得到较大提高，对于高粱的饲用品质的改良具有重要作用。高粱褐色中脉基因BMR-6编码了木质素合成途径上的肉桂醇脱氢酶基因（CAD），而单个CAD基因的缺失往往能够被CAD基因家族其它成员弥补，因而限制了其在分子育种中的应用。这就需要研究者解析参与木质素合成途径上的多个CAD基因的功能。本课题组前期研究发现bmr-6、SbCAD-3和SbCAD-4都可能参与到高粱木质素单体的生物合成。本研究通过时空表达分析表明，SbCAD-4基因的表达模式与BMR-6相似，在茎中的表达量最高，而SbCAD-3基因则在各检测的组织中表达无明显差别。亚细胞定位分析则表明这3个蛋白皆在细胞质中执行其功能。原核表达的酶活分析表明， BMR-6对对肉桂醇和香豆醇的亲和性最强，而SbCAD-3则表现出了对香豆醇和松柏醇较高的亲和性，SbCAD-4对肉桂醇有较高的亲和性。从Vmax/Km的比值来看，BMR-6相比于SbCAD-4和SbCAD-3蛋白来说有更强的酶活性，SbCAD-4比SbCAD-3有更强的酶活性。这表明BMR-6应该在木质素单体合成过程中起主要作用。进一步测定了野生型、bmr-6突变体、RNAi-SbCAD-3和RNAi-SbCAD-4转基因植株T2代的Kalson木质素。结果表明，相比于野生型，bmr-6突变体和RNAi-SbCAD-4转基因植株中的木质素含量明显降低，而RNAi-SbCAD-3转基因植株中Kalson木质素含量与野生型无明显差别。这表明BMR-6和SbCAD-4基因参与了高粱木质素单体的生物合成。另外，本研究还建立了高粱CRISPR/Cas9基因敲除系统，并获得了2株T0代纯全的SbCAD-4基因敲除的转基因系。本研究阐明了BMR-6和SbCAD-4基因参与了高粱木质素单体的合成，而且BMR-6基因应当起主要作用。本研究对于高粱饲用品质性状的改良和分子育种具有重要的意义和价值。