梨果皮褐色形成的分子解析及相关基因克隆

梨果皮表面着色分为"褐色"和"红色"两种类型。目前，国内外有关梨果皮"红色"形成机理研究较多，而关于"褐色"着色机理目前尚未见报道。'砀山酥梨'果皮底色黄绿，果面不着色，而其营养系变异品系'锈酥'果皮表面则着生"褐色"。试验以'砀山酥梨'和'锈酥'为试材，通过构建SSH-cDNA文库，发掘果皮"褐色"形成相关的基因，采用荧光定量PCR技术，分析相关基因在不同基因型果皮中的表达差异，探讨果皮"褐色"形成的分子机理。为梨果皮颜色定向改良、杂种后代"褐色"果皮预先选择、提高梨育种效率奠定基础。

为了深入探讨‘砀山酥梨’及其褐皮芽变‘锈酥’果皮褐色形成机理，本研究利用投射电镜观察二者果皮结构，测定果皮中蜡质和多糖，同时利用不同多胺抑制剂测定处理后H2O2的定位，多胺、木质素单体和H2O2的含量。利用mRNA差异显示和抑制消减文库筛选并克隆二者果皮中差异表达基因，并利用荧光定量PCR进行验证。.花后75 d，‘锈酥’果皮细胞壁比‘砀山酥梨’细胞壁厚。‘锈酥’细胞器开始降解直到完全消失，使得细胞次生壁增厚。‘锈酥’果皮中丙酮酸作为合成前体物质合成的氨基酸均高于‘砀山酥梨’。由α-酮戊二酸、草酰乙酸作为合成前体物质合成的氨基酸含量在‘砀山酥梨’果皮中总体趋势是上升，在‘锈酥’果皮中含量总体趋势下降。‘砀山酥梨’和’锈酥’果实表皮蜡质化学组分包括烷烃、烯烃、链烷酸、醇类、萜类等。二者不同时期果皮中蜡质均为奇数碳原子饱和烷烃为主，且以 C29和C27相对丰度大大高于其余碳数烷烃为特征。‘锈酥’果皮蜡质组分中脂肪醇相对含量均显著高于‘砀山酥梨’。多胺抑制剂CHA处理后的果皮中H2O2积聚物较少。在CHA处理‘锈酥’果皮后，三种多胺的含量均升高；而MGBG处理后，三种多胺的含量均降低；乙烯利处理后腐胺和精胺的含量降低，亚精胺的含量升高。经CHA和MGBG处理后的‘锈酥’果皮中H2O2含量均降低，但乙烯利处理后H2O2含量升高。‘砀山酥梨’果皮中的G、S木质素单体和G+S木质素之和均低于‘锈酥’，CHA和乙烯利处理‘锈酥’果皮后，G、S木质素单体和G+S木质素含量增加，MGBG处理后均降低。. 利用RACE技术克隆出数十个相关基因全长克隆。从正、反向抑制消减文库中分别鉴定出329和366条差异表达基因。正向文库和反向库中转录抑制、木质素、多胺和多糖等基因相对表达量利用real-time PCR进行了验证。综合结果表明，‘砀山酥梨’褐皮芽变‘锈酥’果皮褐色的形成非常复杂，转录因子、蜡质、木质素、多胺和多糖代谢均对梨果皮褐色的形成有重要影响。