利用天然角膜基质微环境和动态培养体系构建自体组织工程板层角膜

体外构建自体组织工程板层角膜为解决供体角膜来源匮乏带来了新的希望。本项目使用磷脂酶A2联合脱氧胆酸钠的特异性脱细胞方法，制备充分满足精密生物力学和高度光学透明性要求的脱细胞猪角膜基质，以解决目前角膜支架力学强度较差和移植后透明性下降的问题。同时利用40%的胚胎干细胞条件培养液，短期大量扩增自体角膜上皮细胞以解决种子细胞来源不足的问题。在此基础上根据角膜的生理学特点，改进传统的气液界面静态培养方法，使用连续灌注培养联合单面负压－气液界面培养的动态培养体系构建自体组织工程板层角膜，通过调整载体中生长因子的比例、浓度、缓释速度和维持时间，连续灌注培养系统中流体剪切力和氧气通气量，单面负压-气液界面培养系统中培养面上的气液转换间隔时间和培养液流量，以及干燥面上的负压程度和气体湿度这些构建参数，促进角膜上皮细胞在构建载体上的增殖、黏附和分化，从而构建出体外、体内具有较完善生理功能的组织工程板层角膜。

本研究旨在制备同时具有良好屏蔽功能、足够力学强度、高度光学透明性并最终满足活体移植要求的组织工程板层角膜。利用脱细胞角膜基质和胚胎干细胞微环境，按照角膜生理学特点和不同时期的构建要求，通过时序控制的方式，顺序使用包括浸没培养、连续灌注培养、动态气液界面培养在内的3步主要流程，实现角膜上皮细胞在构建载体上的有序迁移、增殖、黏附和分化。对于最终构建所获得自体组织工程板层角膜首先进行组织形态学、分化表型、增殖活性和粘附能力的相应检测；然后进行包括跨上皮电阻、体外透光率和应力-应变分析，最后通过新西兰兔板层角膜移植，论证构建角膜的体内整体功能。构建的板层角膜与天然角膜比较，均可形成如生理状态的4~5层活力良好的复层角膜上皮结构，尤其是其基底部细胞具有更为明显的低分化特性，p63,ABCG2表达阳性，K3阴性，克隆形成率显著高于天然中央角膜；角膜上皮层的粘附程度较好，可形成明显的紧密连接、桥粒连接和半桥粒连接的超微结构；而反映其整体屏蔽功能的上皮层膜电阻值，与天然上皮层近似；体外的光学和力学性质与天然角膜比较均无统计学差异。动物实验证实构建角膜的光学，力学和上皮屏蔽性质满足了活体移植所必需的整体功能学的要求，在细胞转归和术后修复方面，也与天然自体板层角膜非常类似。. 通过本项目研究，获国家发明专利授权4项（授权2项），PCT授权1项，申报国外发明专利2项，实施产品产业化1项，相关实验结果正在投稿中。