BM-MSC心肌补片的动态三维构建及体内转归机制

This project is to solve the key problems of constructing Bone Marrow-Mesenchymal Stem Cell (BM-MSC) cardiac patch, including unstable biological function, low mechanical strength and poor cell survival rate after transplantation. Decellularized porcine pericardium (DPP), prepared by using specialized decellularized method (combining apoptosis-inducing and phospholipase A2 decellularization method), would be chosen as a scaffold. Further crosslinking control-release microspheres of multilayer growth factors on DPP scaffold to recover its natural physiological microenvironment. On this scaffold, adequate BM-MSCs would be quickly reconstructed by using nano polypeptide hydrogel, and dynamic culture system would be used for ensuring BM-MSC nutrition supply in vitro. Functional assessments of BM-MSC cardiac patch would be performed in the different levels of dynamic culture condition, dynamic biological stress microenvironment and in vivo transplantation, respectively. To follow, BM-MSC cardiac patch construction parameters would be adjusted according to these functional outcomes, and a BM-MSC cardiac patch with favorable physiological function would be finally obtained. In addition, the study intends to explore the regeneration mechanisms of BM-MSC cardiac patch on myocardium infarction (including angiogenesis mechanism, extracellular matrix remodeling mechanism and immunoregulation mechanism), and it would further evaluate the effects of exogenous BM-MSC on activating and inducing endogenous cardiac stem cell. (12 project-related key technologies have been applied for invention patents, and 5 have been authorized.)

本项目拟解决制约骨髓间充质干细胞（BM-MSC）心肌补片构建的关键问题（生物学功能不稳定，力学强度差和移植后细胞存活率低）。将使用特异性方法（刺激凋亡法联合磷脂酶A2法）制备脱细胞猪心包膜支架；进一步交联生长因子分层缓释微球，最大程度的恢复脱细胞基质支架的生理微环境。在此基础上，联合纳米凝胶重建技术和三维动态培养技术种植足量BM-MSC，实现心肌补片产品的快速体外重建，并提高干细胞负载量。通过动态培养环境、动态应激环境和体内移植三个层面的功能学评价，反馈调整制备体系中的各种构建参数，从而最终制备具有较完善生理功能的BM-MSC心肌补片产品。此外，将初步探讨心肌补片与心梗部位的融合与改建机制（包括血管再生机制、新生基质重塑机制和免疫调节机制），并进一步监测外源性BM-MSC对内源性心脏干细胞的趋化、诱导和稳态恢复过程。（项目涉及的关键技术已申报发明专利12项，授权5项）

本项目已完成BMSC心肌补片产品的制备与体内功能验证的主旨任务。已确定产品的构建参数，形成了稳定的动态培养体系。成功解决了关键科研问题，保证了构建骨髓间充质干细胞心肌补片产品的稳定性。具体进展包括：利用磷脂酶A2脱细胞方法成功制备了脱细胞心包膜（DPP）作为补片的支架材料，DPP的天然胶原结构保存完好；同时使用Asp交联法成功在DPP上建立VEGF缓释系统；另外，本研究在48小时内成功制备得到三维复层结构的BMSCs心肌补片，并论证了体外动态培养系统对维持干细胞生物学活性与功能具有重要作用。在大鼠心梗模型中，观察到动态培养的BMSCs心肌补片（DCcs）对改善心功能以及减少梗死面积具有良好疗效。同时，结果显示DCcs组显著促进梗死区内的血管新生以及组织原位细胞修复状况。以上结果共同论证了动态培养的多层BMSCs心肌补片在精准移植治疗心肌梗死疾病的应用前景。.作为应用研究为产品产业开发，本研究也为后续中试生产准备了相应的大规模生产条件探索，由于脱细胞载体比较方便实现大规模生产，我们主要探讨了关于种子细胞大规模扩增和应激激活的方案。包括：①种子细胞的大规模三维动态培养：使用透明质酸交联的Cultispher-S微载体进行大规模培养，分析了种子细胞在动态培养体系中的生长动力学、代谢动力学及旁分泌特点，已实现间充质干细胞的快速扩增，并显著提升干细胞的代谢、表型和功能稳定。②干细胞应激预适应微球的建立及评价：利用OPC液晶材料自身的流动性和各向异性的特点，将干细胞接种到液晶材料上以后，细胞形成细胞团，外围细胞发生焦亡反应，模拟体内炎症环境，内部细胞受到这种环境的刺激，对炎症环境具有更强的适应力以及更高的细胞活性和干性，为应激炎症环境疾病治疗提供更好的种子细胞。.研究涉及的内容，申报发明专利6项，申请PCT1项，获授权专利5项，主要制备流程已发表SCI论文2篇（其中AI-1论文1篇），3篇论文在投稿中。