利用CRISPR-Cas9技术研究HvGAPCs基因调控自噬和免疫反应的作用机理及其在大麦抗病改良中的应用

Disease is an important constraint upon barley productivity and quality. It has been reported that autophagy regulates immunity-related programmed cell death, which is critical in plant defense against biotrophic pathogens. Our previous studies have identified several autophagy-related genes (ATGs) and two putative genes encoding Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases (GAPCs) in barley, whose expression was induced in response to pathogens treatment. This project aims to construct knock out mutants of HvGAPC using CRISPR-Cas9 based genome editing method, and investigate the function of HvGAPC in regulation of ROS, autophagy, plant immune response and disease resistance. The project also includes analysis of subcellular localization of HvGAPC and identification HvGAPC-interacting partners in autophagy pathway. The mechanism of GAPCs-mediated regulation of plant innate immunity could provide new strategies for breeding resistant barley through the CRISPR/Cas9 system.

大麦病害是影响其产量、品质和食品安全的重要因素之一。本申请利用CRISPR-Cas9技术，研究HvGAPCs基因调控自噬和免疫反应的作用机理及其在大麦抗病改良中的应用。以筛到的受真菌感染诱导表达的大麦胞质3-磷酸甘油醛脱氢酶(HvGAPCs)基因，构建大麦HvGAPC敲除突变体，分析胞内ROS水平和自噬表型变化，明确HvGAPCs对ROS和自噬基因活性的调控功能；采用真菌感染试验，考察HvGAPCs突变对超敏反应介导的程序性细胞死亡（HR-PCD）和大麦广谱抗病性的影响；通过HvGAPCs细胞学定位和互作蛋白解析，明确HvGAPCs与自噬途径的关联及调控自噬的靶点。最后阐明大麦HvGAPCs通过与自噬蛋白（ATGs）互作，调节ROS水平和自噬活性，参与免疫反应调控的广谱抗性分子机理，基于CRISPR-Cas9和杂交等技术，获得“无转基因痕迹”材料，为大麦广谱抗病改良提供理论依据和技术支持。

大麦(Hordeum vulgare L.)是世界上最主要和最古老的栽培作物之一。大麦病害是影响大麦产量、品质以及食品安全的重要因素之一。本课题组以细胞自噬为切入点进行了关于大麦抗病抗逆性状遗传改良的工作。作为植物抗胁迫的一种重要机制，细胞自噬受到诸多内外因素的控制和影响。本项目利用CRISPR/Cas9技术构建了大麦Hvgapc突变体材料，证明了功能丧失突变体Hvgapc具有比野生型大麦更高的自噬活性。阐明HvGAPC蛋白具有通过与ATG3结合负调控大麦细胞自噬的功能。初步验证了HvGAPC蛋白与ATG3互作参与大麦细胞自噬调控及抗病中的作用。通过后代的分离筛选获得了“非转基因”（无转基因痕迹）的大麦新材料，为进一步开展大麦广谱抗病性遗传改良的大田实验提供了安全的遗传材料。此外，本项目运用免疫沉淀与蛋白质质谱联用技术鉴定了大麦愈伤组织中多个新的ATG8互作蛋白，绘制了大麦ATG8互作蛋白网络。通过免疫共沉淀（Co-IP）以及双分子荧光互补实验（BiFC）验证了这些蛋白在体内与大麦ATG8蛋白的相互作用。发现60S酸性核糖体蛋白RPP3通过经典的自噬受体结合结构域LIR和ATG8蛋白直接结合并参与到大麦内质网自噬过程中。据我们所知，RPP3是目前发现的第一个植物特有内质网自噬受体。该研究成果为进一步探索新的植物自噬受体和功能提供了创新性的基础。