自噬在番茄耐热性中的功能、作用机理和调控

High temperature can directly lead to denature and inactivation of proteins, which can then form protein aggregates. Although the ability to eliminate these denatured or misfolded protein aggregate is critical for the survival of plant cells under high temperature, the specific pathways and mechanisms involved are still poorly understood. Based on a large body of preliminary studies, we have hypothesized that selective degradation of these denatured/inactivated proteins by autophagy is critical in plant thermotolerance. This proposed project will continue to use tomato as a model to test the general hypothesis. RNAi (using both VIGS and transgenic RNAi plants) will be used to silence the expression of autophagy-related genes ATG5 and ATG7 and examine the impact on tomato thermotolerance in order to determine the role of autophagy in plant thermotolerance. RNAi will also be used to silencing the AIP3 gene encoding a putative autophagy receptor with an ubiquitin-binding domain and the impacts on tomato thermotolerance and the accumulation of ubiquitinated proteins will be analyzed. Ubiquitinated proteins recognized by the AIP3 receptor will also be isolated and identified. Finally, the roles of WRKY33 transcription factor in the regulation of induction of autophagy will be analyzed and the targeted ATG genes will be identified. These proposed studies are expect to elucidate the roles, action mechanisms and regulation of autophagy in tomato thermotolerance, which can, in turn, lead to development of new strategies to improve stress tolerance, yield and quality of vegetable crops.

高温对细胞的直接损害包括蛋白变性失活并形成无法复性的聚合体。能否有效地清除这些永久失活的有害蛋白决定植物细胞在高温条件下的生死存亡。申请者在前期工作基础上提出了细胞自噬选择性清除变性失活蛋白并在植物高温应答机制中起着重要作用的假说。本项目拟以番茄为材料，利用VIGS和RNAi转基因研究自噬关键因子ATG5和ATG7在番茄耐热性中的功能；利用RNA干扰验证带有泛素结合域的自噬推理受体AIP3在番茄耐热性中的功能，明确高温条件下番茄耐热性和泛素化蛋白积累的关系，分离鉴定与AIP3互作的泛素化变性失活蛋白，明确自噬识别、捕获并最终清除高温下形成的变性蛋白的作用机理；研究番茄WRKY33转录因子对高温诱导自噬的重要性，利用染色质免疫沉淀法验证WRKY33和重要自噬相关基因启动子的互作关系，阐明高温诱导自噬过程中的一个重要调控机制。研究可望在进一步探明植物耐热性的分子机理，探索蔬菜抗性调控新途径。

自噬是真㧡生物降解细胞成分的重要途径。大量通过拟南芥自噬突变体的研究表明自噬在植物抗盐、抗干旱及抗氧化化面具有重要作用，但在抗热性的功能尚无报道。本项目的研究目标是明确自噬在番茄耐热性中的功能，並阐明其作用和调控机理。主要研究内容包括：1）利用VIGS和RNAi沉默番茄自噬相关(ATG)基因，明确自噬在番茄耐热性中的功能，2）通过基因沉默及其它生物化学方法研究选择性自噬受体AIP3(已更名为NBR1)在番茄耐热中的功能及捕获高温变性蛋白的机理，3）利用基因沉默及其它分子生物学方法研究番茄WRKR33转录因子在高温诱导自噬及番茄耐热性中的调控作用和机理。项目经过四年研究工作基本完成了预定的研究内容和目标。项目研究的主要结果包括：1）通过分子和细胞生物学方法发现高温诱导番茄自噬基因表达及自噬体的形成；通过RNA干扰沉默番茄ATG5及ATG7基因之后，番茄对高温的敏感性增高，表现在高温下叶片光合作用活性下降及叶子死亡速度加快。这些结果说明自噬在番茄耐热性中具有重要功能；2）通过RNAi干扰沉默番茄AIP3基因可从显著降低番茄耐热性，同时发现AIP3沉默之后番茄在高温下积累的不可溶蛋白聚会体增加，另外发现高温下AIP3含量增加，并不断和不可溶蛋白聚合一起，根据这些发现，我们推定自噬在高温下通过AIP3选择性识别、捕获並最终清除有害的变性蛋白，从而提高番茄在高温下的存活率，3）通过RNAi干扰沉默番茄WRKY33之后，发现番茄耐热性下降，同时高温诱导的自噬基因表达及自噬体形成受到显著影响，利用染色质免疫沉淀发现WRKY33和多个自噬基因启动子结合，这些结果表明番茄WRKY33是番茄耐热性的重要调控因子，其作用机理至少一部份通过调控高温下自唾的诱导。这些研究成果基本阐明了自噬在番茄耐热性中最基本的生物学问题，开辟植物耐热分子机理研究的新领域，建立了一条提高作物抗性的新途径。