靶向M细胞的PEDV S 蛋白亚单位疫苗的构建及免疫机理

Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）is an virus which tend to intestinal tissue, and the local gut mucosal immune system plays an important role in the anti-PEDV infection. Co1 has been demonstrated that it could target M cells, meanwhile，attenuated Salmonella plays a significant role not only carry exogenous antigen gene, but also can sustain expressing the antigen in vivo. Therefore, we constructed a recombinant attenuated Salmonella strain ΔasdC500(pYA3493-Co1-S1) which was stablely carrying and expressing Co1 and S1 genes by host-vector balanced-lethal system, then explored the targeting efficiency and characteristics of the recombinant strain to M cell, and this study focuse on the mechanism of inducing the immune response of the recombinant bacteria as a target vaccine, this study can provide a theoretical basis for developing a new oral vaccine of PEDV.

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是具有肠道组织嗜性的病毒，肠道局部黏膜免疫系统所发挥的作用在抗PEDV感染中起着重要的作用。Co1是M细胞配体，可被特异性识别。鉴于Co1靶向M细胞的特性，而减毒沙门菌具有携带并持续表达外源抗原基因的能力。本项目拟在前期研究的减毒猪霍乱沙门菌平衡致死系统∆asd C500(pYA3493)的基础上，构建能够稳定携带Co1并稳定表达PEDV S1蛋白的重组减毒沙门菌 ΔasdC500(pYA3493-Co1-S1)，研究该重组菌在体外M样细胞及体内肠道pp结的靶向效率及特性，重点探讨该重组菌作为动物用靶向疫苗诱发免疫应答的机制，为PEDV新型口服疫苗的研发提供一定的理论依据。

猪流行性腹泻(PED)是高度接触性肠道传染病。M细胞是特化的肠黏膜上皮细胞，在转运抗原中发挥重要作用。PEDV纤突糖蛋白S在介导中和抗体产生中发挥重要作用。本研究构建了能够稳定携带M细胞配体Co1并表达S蛋白的重组猪霍乱沙门菌∆asdC500(pYA-Co1-S1)，探索了重组菌作为靶向疫苗诱发免疫应答的作用及机理。.从临床采集到疑似PEDV感染病料87份，经RT-PCR检出阳性病料45份，检出率为51.72%。分子流行病学研究表明流行株与CV777遗传距离较远。构建了重组菌株BL21(pET-28a-S1)和BL21(pET-28a-rM)，对重组菌进行了表达条件优化，制备了高效价的多克隆抗体。建立了特异性和敏感性较高的基于PEDV N基因的重组酶聚合酶扩增结合侧流层试纸条检测PEDV方法(RT-RPA-LFD)，临床检测实验表明该方法检测结果与RT-PCR检测结果的符合率为96.5%，具有较好的临床应用前景。.成功构建了重组菌∆asd C500(pYA-Co1-S1)，该菌保留了与亲本菌株C500相一致的生化特性，能够稳定遗传携带的Co1-S1基因，生长速度略低于亲本菌株C500。同时，重组菌在体外能够表达携带的Co1-S1蛋白，且表达的蛋白与兔抗S1高免血清具有较好的反应原性。 .初步建立了M样细胞体系，将重组菌株∆asd C500(pYA-S1)和∆asd C500(pYA-Co1-S1)与构建的体系作用后进行菌落实验，表明pYA-Co1-S1组粘附细菌数显著高于pYA-S1组。重组菌动物后，在实验的第1W末、第3W末和第6W末采集了血清、粪便等样品，结果表明，pYA-Co1-S1组在诱导机体产生S1特异性IgG、IgA方面均高于pYA-S1组，同时诱导了高水平的粪便分泌性的IgA；血清高水平的IFN-γ及IL-4含量表明，pYA-Co1-S1组诱导了较强的Th1/Th2的免疫效应；在实验的第6W末采集仔猪脾脏及血液，淋巴细胞转化试验表明，pYA-Co1-S1组仔猪体内产生了较强的细胞免疫应答反应；Eli-spot实验则证明了pYA-Co1-S1组分泌S1特异性抗体的细胞显著高于pYA-S1组。总之，本研究构建的重组沙门菌∆asd C500 (pYA-Co1-S1)诱导机体产生了较强Th1/Th2的免疫效应和较高的黏膜抗体，具有潜在的应用前景。