携带TGEV S和PEDV S双基因的减毒沙门氏菌口服疫苗的免疫机制研究

猪传染性胃肠炎（TGE）和猪流行性腹泻（PED）是两种最常见的猪肠道病毒病。肠道粘膜免疫对TGE和PED的防控具有重要意义，提高疫苗诱导肠道粘膜免疫水平是新型疫苗研究的重要方向。本研究拟构建携带TGEV S基因（St）和PEDV S基因(Sp)的双基因减毒沙门氏菌口服疫苗，并研究其特殊的口服免疫诱导机制。用RT-PCR扩增St、 Sp基因，将两个基因拼接后插入pVAX1载体，构建表达质粒pVAX-St/Sp，再电转化入减毒沙门氏菌SL7207中，筛选获得疫苗菌株SL7207（pVAX-St/Sp），并对筛选的疫苗菌株进行全面的生物学特性鉴定；将疫苗菌株SL7207（pVAX-St/Sp）口服免疫小鼠和猪，研究其口服免疫的诱导机制（细胞免疫、体液免疫动态规律、肠道局部粘膜抗体sIgA动态规律、抗体中和活性分析、攻毒保护试验等）。本研究对TGE和PED的防控具有重要的学术价值和应用前景。

本研究以减毒沙门氏菌为载体构建了PEDV S和TGEV S双基因口服疫苗，并口服免疫小鼠及仔猪阐明其免疫诱导机制。以RT-PCR扩增PEDV的S基因抗原编码区域（简称Sp ，长2367bp）及TGEV的S基因主要抗原编码区（简称St ，长1896bp，编码S蛋白N末端1-632氨基酸位点），插入双启动子真核表达载体pVAXD中构建了pVAXD-St/Sp表达载体。经免疫荧光法鉴定Sp基因和St基因可在COS-7细胞中正常表达，将pVAXD-St/Sp电转入鼠伤寒减毒沙门菌SL7207中，构建了携带双基因的重组减毒沙门菌SL7207（pVAXD-St/Sp ），通过口服免疫仔猪及小鼠，研究其口服免疫机制。本研究取得的成果如下：（1）构建了可共表达PEDV S基因和TGEV S基因的双启动子真核表达质粒pVAX-St/Sp；（2）构建了携带PEDV和TGEV S双基因的口服疫苗SL7207（pVAX-St/Sp ），该菌株具有良好的体内稳定性、体外稳定性，口服免疫小鼠具有安全性；（3）双基因疫苗SL7207（pVAX-St/Sp ）具有良好的免疫原性，同时具备两个S基因的免疫功能，可诱导针对两个S蛋白的免疫反应（包括体液免疫、肠道粘膜免疫和细胞免疫反应。口服免疫小鼠和仔猪后，2周～8周均可检测到明显的血清IgG和肠道粘膜IgA抗体；可诱导明显的外周血和脾脏T淋巴细胞增殖反应；可诱导产生明显的IFN-γ和IL-4水平；诱导产生的抗体具有病毒中和能力。仔猪免疫试验结果还表明，双启动子口服疫苗SL7207（pVAX-St/Sp）可诱导的细胞免疫效果优于单基因免疫组。本研究为评价TGEV和PEDV双基因口服疫苗提供了为科学依据，为后续口服疫苗的应用奠定了基础，具有重要的学术价值和应用价值。