Trametinib克服ALK耐药性突变的机制研究

Genetic abnormalities in ALK gene are common seen in many types of human cancers, targeted therapy against ALK quickly develops resistant mutations, which are no longer sensitive to most current therapy approaches. By a high-throughput screening of all commercially available therapeutic drugs, our group discovered that a MEK inhibitor, Trametinib，can potently overcome the drug resistance conferred by mutations in ALK gene， which is of great therapeutic significance. Primary data suggest that, Trametinib might target an unknown gene other than MEK to achieve its anti-proliferative effects, in which p27, a CDK inhibitor, might also be closely involved. In this proposal, we are going to explore the cellular effects of Trametinib in signaling transduction, apoptosis, and cell cycle progression, and pinpoint the step where Trametinib induces p27 protein accumulation, at either transcription, translation, or protein degradation levels. Also, with the aids of gene expression array analysis and mutation analysis in induced drug-resistant cell lines, combining the results from other experiments, we will search and verify the unknown target of Trametinib, and disclose the detailed mechanism of how Trametinib overcomes the drug resistance. In addition to providing solid experimental data support for extending the use of Trametinib to novel therapeutic approach against ALK-based drug resistant mutations, this proposal will also inspire novel drug targeting methods and directions to overcome acquired drug resistant mutations in other kinases.

多种人类肿瘤带有ALK激酶的基因异常，而针对ALK的靶向药物在临床上出现的耐药性突变一直没有有效的药物。本课题组前期通过高通量细胞筛选，发现了Trametinib能够有效地克服由ALK激酶突变引起的耐药性,具有重要的临床意义。初步数据显示，Trametinib很有可能通过除MEK之外的一个未知靶点来实现对细胞增殖的抑制，并且CDK激酶抑制剂p27可能起到了重要的作用。本项目拟通过对信号通路，凋亡和细胞周期等角度检测Trametinib对细胞产生的影响，解析其诱导p27蛋白水平增高的机制。利用表达谱芯片结合诱导耐药细胞突变测序的分析手段，寻找并确定Trametinib的未知作用靶点，阐明该靶点被Trametinib打击后抑制细胞增殖的机制。本项目不仅将为Trametinib在临床ALK耐药性肿瘤上的潜在应用打下坚实的理论和实验基础，并且将为其他更多激酶耐药性突变的新药研发提供新的思路和方向。

激酶靶向小分子抑制剂在临床肿瘤治疗中广泛应用，但长期使用引起的耐药性一直是肿瘤治疗和研究中的难题，因而发现并明确克服耐药发生的机制成为解决这一难题的关键。前期研究中我们发现MEK 抑制剂 Trametinib对ALK耐药突变细胞具有抑制增殖的作用，因而我们以此为切入点对其内在机制进行探究。本项目拟从解析药物作用靶点的角度，利用生物化学和分子细胞生物学技术，探究 Trametinib能够克服临床上出现的 ALK耐药性突变的分子机制，明确该药物对 ALK 耐药性细胞株发挥细胞杀伤作用的直接作用靶点以及对细胞内信号通路的影响，为 Trametinib 在针对 ALK 耐药性突变病人的潜在临床应用提供理论依据。依据项目书计划，为寻找并确定Trametinib克服ALK耐药性突变的直接作用靶点，我们通过对非小细胞肺癌细胞系进行长时间的药物处理诱导，获得了两个稳定的单克隆耐药细胞株，并对这些耐药细胞株进行了各种组学的检测和分析。基因测序分析发现了若干可能引起Trametinib耐药的关键基因突变，包括CDK19、DRD1等；蛋白质组学分析及生化实验验证表明耐药细胞内mTOR信号通路的异常激活，可能直接参与了耐药机制的发生，表明Trametinib很有可能通过调控mTOR信号通路发挥克服ALK激酶抑制剂耐药作用的。除此之外，为在人类激酶组中寻找Trametinib可能打击并引起ALK耐药性突变的靶点，我们利用前期开发的细胞构建方法，扩大设计并构建了包含230余个细胞系在内的基因工程细胞，涵盖了目前与人类肿瘤发生和发展相关的70余个激酶靶点和大部分目前临床发现的肿瘤激酶突变。不仅为寻找Trametinib的脱靶激酶蛋白提供了独特的研究工具，并且为学术同行和创新药物研究机构提供了重要的药物活性检测体系，具有潜在的成果转化前景。