ERβ/Nrf2在幽门螺杆菌诱发胆道上皮恶性转化中的作用机制研究

Hp can induce malignant transformation of biliary epithelium. However, the mechanism still remains unknown. Our preliminary research found that ERβ expression in Hp infected-biliary epithelial cells was inhibited, and up-regulated ERβ expression could block the malignant transformation. The above results might be related to that ERβ could regulate the expression of Nrf2 gene. Nrf2 plays the key role in antioxidant pathway Nrf2-ARE which is important for radical scavenging and cell canceration inhibiting. In order to clarify the mechanism of ERβ/Nrf2 in Hp-induced malignant transformation of biliary epithelium , the following experiments were planned: ①establish the Hp-infected biliary epithelial cell model; ②lentivirus transfection mediate the up-regulated and silence of ERβ/Nrf2 in the cellular model, and, the soft agar assay, Transwell, the oncogenesis model in nude mice as well as detection the expressions of cell proliferation and anti-apoptosis related genes were performed to analyze the malignant transformation. ③investigate the regulatory function of ERβ in Nrf2 activation, transcription, translation and its coactivator Keap-1. We hypothesized that ERβ/Nrf2 was the key factor in Hp-induced biliary epithelial malignant transformation and we hope this study can provide a scientific basis for elucidating the mechanism of Hp in biliary carcinogenesis.

Hp可诱发胆道上皮恶性转化，但机制不明。前期研究发现：Hp感染的胆道上皮细胞中ERβ表达受抑制，上调ERβ则能阻断恶性转化，可能与ERβ对Nrf2基因的表达调控有关。Nrf2是抗氧化通路Nrf2-ARE的中心环节，对于清除自由基、抑制细胞恶变具有重要意义。为阐明ERβ/Nrf2在Hp诱发胆道上皮恶性转化中的作用机制，本课题拟进行下列实验：①构建Hp感染的胆道上皮细胞模型；②慢病毒转染技术上调和沉默模型中ERβ及Nrf2的表达，并通过软琼脂集落实验、Transwell、裸鼠成瘤实验、检测增殖和抗凋亡相关基因的表达等手段分析胆道上皮的恶性转化水平；③考察ERβ对Nrf2的激活、转录、翻译及其活化辅助蛋白Keap-1的调控作用。本研究提出ERβ/Nrf2是Hp诱发胆道上皮恶性转化的关键因子，希望可能为明确Hp在胆道中的致癌机理提供一定的科学依据。

雌激素和H.pylori是诱发胆囊黏膜恶性转化的两个潜在危险因素，本课题主要研究两者作用于胆道上皮细胞HIBEC后对其增殖、凋亡、迁移能力以及氧化性DNA损伤的影响以及两者对氧化应激相关通路Nrf2/ARE以及凋亡通路的影响。将17β-雌二醇（10-9mol/L）以及H.pylori（MOI=1:1）作用于HIBEC细胞并反复传代至15代后，进行：（1）CCK-8、免疫细胞化学检测Ki-67的表达水平以及平板克隆实验探究细胞增殖能力；（2）Annexin-V/PI检测凋亡水平；（3）Transwell检测迁移侵袭能力；（4）流式细胞术检测ROS的表达水平，荧光染色观察8-OHdG的表达，评价氧化性DNA损伤情况。然后利用：（1）RT-PCR以及Western-blot检测Nrf2、Keap-1、NQO-1、HO-1的转录和翻译水平；（2）免疫荧光双染以及Western-blot检测细胞核与胞浆中Nrf2蛋白的表达水平，探究Nrf2是否转位入核；（3）Co-IP检测Nrf2与Keap-1的相互作用；（4）EMSA检测Nrf2与是否与NQO-1的DNA结合；（5）Western-blot检测凋亡通路中关键蛋白酶的表达水平。我们发现：H.pylori以及17β-雌二醇可单独或协同促进HIBEC细胞：OD450值、Ki-67表达水平以及克隆形成率均显著升高（p=0.000），凋亡率降低（p=0.011以及0.005），穿膜细胞数显著增加（p=0.010以及0.000）；ROS以及8-OHdG的表达（p=0.000）；促进HIBEC细胞Nrf2、Keap-1、NQO-1、HO-1的转录和翻译（p<0.05）、细胞核内Nrf2表达水平增强（p<0.01）、促进Nrf2与Keap-1解离（p=0.000）、Nrf2与NQO-1 DNA结合（p=0.000）以及抑制凋亡通路中关键蛋白酶的表达（p=0.000）。本研究发现：H.pylori以及雌激素可单独或协同促进HIBEC细胞发生氧化应激和DNA损伤、促进增殖并抑制凋亡。