HBV cccDNA表观遗传学调控的图谱解析与机制研究

The persistent stability of HBV cccDNA is one major obstacle preventing HBV cure. Recently, we have found that the stability of cccDNA is not related to its genome replication or any viral proteins, but is instead mainly determined by a specific viral DNA sequence. Therefore, we hypothesize that the special structure of cccDNA minichromosome generated by epigenetic modification is the key for its extreme stability. What kind(s) of epigenetic modification determines the cccDNA stability? How does the modification regulate cccDNA function and stability? Through using our minicircle HBV cccDNA system and screening a small chemical library containing inhibitors against some epigenetic modification enzymes, we have identified a specific histone methylation that suppresses the cccDNA transcription and makes it more stable. In this project, we will first generate a more comprehensive chemical library covering all epigenetic inhibitors and map the epigenetic regulation profile of cccDNA. We will then study in detail the mechanism in cell culture using multiple molecular methods. Finally, we will explore the possible strategies to clear cccDNA by targeting specific epigenetic modification in both transgenic mice carrying minicircle HBV cccDNA and liver humanized mice supporting high level HBV replication. We will extensively profile the epigenetic modification of cccDNA and indentify the key mechanism regulating cccDNA persistence, providing new directions in designing novel therapeutics to clear cccDNA.

HBV cccDNA持续稳定存在是治愈的主要障碍。最近，我们发现cccDNA稳定性与其特定DNA序列密切相关，而与病毒复制、蛋白表达无关。我们猜想：表观遗传修饰产生的特殊结构是cccDNA异常稳定的关键因素。那么，何种表观遗传修饰决定cccDNA稳定性？其调控机制是什么？利用首创的微环cccDNA报告系统，我们已筛选到部分表观遗传调控位点的抑制性化合物，发现组蛋白甲基化抑制cccDNA转录并使其在细胞内保持稳定。本研究中，我们拟进一步完善针对表观遗传修饰的化合物库，全谱描绘cccDNA表观遗传调控图谱；通过分子生物学等手段在细胞水平解析表观遗传修饰调控cccDNA的机制；基于携带cccDNA小鼠模型及可支持HBV高水平复制的人源化小鼠模型，探索靶向表观遗传修饰清除体内cccDNA的策略。本研究所阐明的cccDNA表观遗传修饰特点与维持稳定关键机制将为设计清除cccDNA新型药物提供新思路。

乙肝是威胁我国生命健康的最大的慢性病毒性传染病，难于根治主要原因是HBV 的复制模板cccDNA，但对其生物学特征了解较少。HBV cccDNA在体内与组蛋白形成微小染色体，因缺少模型，HBV cccDNA的表观遗传学调控机制仍不完全了解。本课题主要发现如下：.1. 利用HBV cccDNA细胞转染模型，评价了涵盖已知靶点的表观遗传学化合物，发现，HDAC、HMT、Aurora Kinase、PARP、HIF功能抑制后可以激活HBV cccDNA活性，说明这几个修饰起到抑制HBV cccDNA活性的作用；而HDMT、Bromodomain、Pim功能被抑制后，HBV cccDNA的活性也被抑制，说明，其促进HBV cccDNA转录；SIRT、STAT不参与HBV cccDNA活性调节。提供了表观遗传调控全景图。.2. HDAC 家族中HDAC1、3、6、8主要参与HBV cccDNA功能抑制。HMT家族中，EZH2和G9a/GLP起到抑制HBV cccDNA作用。Aurora-A、B、C均参与HBV cccDNA抑制。BRD4、BRPF1/2、SMARCA2/4参与HBV cccDNA活性维持。.3. 我们对G9a/GLP调控机制进行深入研究，证明，G9a/GLP所调控的蛋白H3K9me2可结合HBV cccDNA并使cccDNA处于转录部分抑制状态，低水平转录保证了cccDNA在体内的稳定性。.4. 构建了可自主产生HBV cccDNA的细胞模型，该模型避免了细菌来源HBV cccDNA,更稳定，随后我们筛选2000个化合物，发现一些有意义的调控HBV cccDNA活性药物，该模型是研究HBV cccDNA更便捷高效的模型。.5. 在干扰素受体人源化小鼠模型中，第一次在小鼠模型中重现了干扰素可以降低表面抗原现象，为后续探索干扰素通路调控HBV cccDNA表观遗传奠定了基础。.