HBc与HBV增强子I结合对cccDNA微染色体转录和表观遗传学的影响及机制研究

Persistence transcription of HBV cccDNA minichromosome in the nucleus is a main cause of HBV persistence infection and difficult healing, but the molecular mechanism of its maintaining high efficiency transcription is not fully understood. Our prophase studies showed that HBV core protein (HBc) binds preferentially to enhancer I (Enh I) of cccDNA minichromosome, furthermore, have a positive correlation with the co-enrich on enhancer I of CBP which promote the high efficiency transcription of cccDNA, meanwhile, the abundances of HBc binding to Enh I have a negative correlation with methylation level of Enh I and amounts of HDAC1 binding, these results prompt that the binding to cccDNA Enh I of HBc may have a close relation with the transcription activity of CBP and the epigenetic change of cccDNA. Therefore, this project proposes, on cell and molecul level, to researchs the contribution of HBc to the transcription activity of CBP and the epigenetic change of cccDNA by the methods of the mutants analysis, reporter gene expression analysis, ChIP and EMSA etc, to elucidate the molecular mechanism of the contribution of HBc to the presistence transcription of cccDNA, and to reveal the transcription regulation mechanism of HBc to cccDNA minichromosome, which could previde evidences of the theoretical and application to inhibit the transcription of cccDNA minichromosome.

存在于细胞核中的HBV cccDNA微染色体的持续转录是HBV持续感染、难于治愈的主要原因，但其持续高效转录的分子机制仍未完全阐明。我们的前期研究表明HBc易与cccDNA微染色体增强子I（Enh I）结合，且与能促进cccDNA高效转录的转录共激活因子CBP有共富集现象，同时HBc在Enh I的含量与该区CpG甲基化程度和HDAC1含量相关，提示HBc与cccDNA Enh I的结合对CBP的转录活性和cccDNA的表观遗传学变化有着密切的关系。本研究拟通过HBV C基因突变体、HBc突变蛋白，综合运用报告基因、siRNA、ChIP及EMSA等蛋白转录活性及蛋白-DNA相互作用的分析方法，从细胞和分子水平，研究HBc对CBP转录活性及对cccDNA表观遗传学修饰的影响，阐明HBc对cccDNA持续转录影响的分子机制，为揭示HBc对cccDNA转录调控机制，进而抑制其转录提供理论和应用证据

HBV cccDNA微染色体的持续转录是HBV持续感染、难于治愈的主要原因。其持续转录受细胞因子和病毒因子两方面的调控，而病毒蛋白对病毒基因转录的作用和机制仍未完全阐明。我们前期研究表明HBc易与cccDNA微染色体增强子I（Enh I）结合，并且与能促进cccDNA转录的转录共激活因子CBP(cAMP 反应元件结合蛋白的结合蛋白)有共富集现象。为此本课题拟研究HBc对CBP转录活性的影响及作用机制。研究表明：①HepG2细胞中的荧光报告基因实验显示，HBc对于2×CRE的转录激活水平是空白对照组的2.36倍，对HBV CRE段序列荧光报告基因载体的转录激活作用，是空白对照组的5.52倍；对HBV Enh I的荧光报告基因载体的转录激活作用，是对照组的3.46倍。说明HBc可提高HBV增强子I的CRE元件的转录活性，进而提高下游基因的转录水平；②为了明确HBc C端精氨酸富集区的磷酸化状态是否影响其转录调控功能，首先分段研究不同片段HBc蛋白分子的转录激活作用，结果显示只有完整的HBc蛋白分子才具有CRE的转录激活作用；进一步研究HBc C端（CTD）的3个磷酸化位点（155、162和170位点）的磷酸化状态对转录活化作用。CTD 3个丝氨酸非磷酸化或155丝氨酸位点磷酸化的HBc具有转录活化作用；而155、162和170位点均磷酸化或162、170位点磷酸化的HBc不具转录激活作用。③用forskolin处理CRE报告基因转染的细胞，可显著提高HBc对CRE的转录激活，提示HBc的CRE转录激活作用是与CREB-CBP转录激活相关。④采用EMSA证明HBc可非特异的结合CRE,增加CREB与CRE的结合；⑤细胞核HBc与CREB、CBP可在CRE区域共占据，并可增加CREB和CBP在CRE的富集，HBc未与组蛋白脱乙酰基酶HDAC1在CRE区域共富集。上述结果提示：HBc可以结合于Enh I的 CRE区，促进CRE结合蛋白（CREB）富集于CRE区，进而增加CBP在CRE的富集，提高下游基因的转录水平；虽然，相对于通常的转录因子，HBc的CRE-CREB-CBP转录激活作用可能不高，但CBP具有组蛋白乙酰化作用，因此HBc可能具有维持cccDNA微染色体表观活化状态的作用，对维持HBV隐匿型持续感染有重要作用。该研究结果为肝细胞HBV持续感染的机制研究打下基础。