灰盖鬼伞菌柄伸长生长停止过程中细胞壁成熟作用的分子机制研究

We previously have explored that some chitinases from Coprinopsis cinerea function as a cell wall loosening reagent and the chitinase-hydrolysis mediates stipe cell wall extension. However，the chitinases only show a strong activity of reconstituted heat-inactivated apical stipe cell wall extension whereas show a little even no activity of reconstituted heat-inactivated basal and basal swollen stipe cell wall extension. These results suggest that some changes of the components, structures and linkages of cell wall should occur during the maturation of cell wall along with cessation of stipe elongation growth, which lead to loss of susceptibility of the cell wall to chitinases. In this project, our specific objectives are (1) Analyze and compare the differences of components, structures and linkages of cell wall between elongating apical stipe region and non-elongation basal and basal swollen stipe regions to elucidate the changes of cell walls during the maturation of cell wall along with cessation of stipe elongation growth; (2) Study on restoration of stipe mature cell wall susceptibility to chitinases by pretreatment with specific C. cinerea hydrolysases to find out which component or linkage among changed components, structures and linkages in cell walls is a key control factor for the maturation of cell wall; (3) Determine effects of RNAi-mediated downregulation of related polysaccharide synthase or linkage catalyzing enzyme on the maturation of stipe cell walls in vivo to functionally confirm the putative key control factor for the maturation of cell wall. We propose to elucidate the molecular mechanism of the maturation of stipe cell wall during the development of C. cinerea fruiting bodies.

我们前期研究证明灰盖鬼伞几丁质酶起着细胞壁扩张蛋白功能，其水解作用介导菌柄细胞壁伸长生长。但几丁质酶只能重组热灭活菌柄顶端细胞壁伸长活性，而重组热灭活菌柄基部细胞壁伸长活性非常微弱或没有，提示菌柄细胞壁成熟过程中，细胞壁结构、组成和交联作用发生了改变，导致对几丁质酶敏感性丧失。预研发现多糖水解酶预处理能恢复成熟菌柄细胞壁可扩张性，被几丁质酶诱导伸长。本项目研究菌柄从伸长区到非伸长区转换的成熟过程中细胞壁化学组成、结构和交联作用的变化，通过多糖水解酶恢复成熟菌柄细胞壁可扩张性研究从上述的众多变化中确定起关键作用的化学成分或交联键，并采用RNAi干扰方法下调合成细胞壁成熟的关键多糖成分或交联键的关键酶基因表达，以功能验证是否可以阻遏细胞壁成熟作用发生，从而阐述灰盖鬼伞菌柄细胞壁成熟作用的分子机制。该研究结果对以菌柄为主要食材的食用菌品质改良和对食用菌多糖药物的开发都具有一定的指导意义。

本项目已有4篇论文发表在一区Top SCI收录杂志，1篇发表在2区（IF6.727）杂志，申请1项国家发明专利，培养2名博士、8名硕士毕业。担子菌子实体生长依赖细胞分裂和细胞伸长生长。真菌细胞包裹有细胞壁，其伸长生长需要细胞壁松弛以扩大细胞壁表面积。真菌细胞壁主要由几丁质和多种葡聚糖组成的网格骨架结构所组成，几丁质酶在菌柄伸长生长过程中通过部分降解几丁质成分而松弛细胞壁。伸长生长主要发生在幼嫩的菌柄顶端区域，沿顶端向基部区域伸长生长逐渐停止。顶端菌柄伸长区片段可被酸性缓冲液诱导伸长，而基部菌柄片段则不能。加热灭活内源性酶蛋白活性后，酸诱导顶端菌柄伸长作用消失；外加几丁质酶可以重组诱导热灭活-顶端菌柄酸诱导伸长作用，但不能重组热灭活-基部菌柄酸诱导伸长作用。但基部菌柄细胞壁成熟过程中细胞壁化学组成、结构和交联程度发生了哪些变化，导致菌柄细胞壁可扩张性丧失的机制尚不清楚。本项目从灰盖鬼伞子实体提取液中发现一种内切β-1,3-葡聚糖酶ENG,预处理基部成熟菌柄片段后，能使预处理成熟基部菌柄片段被几丁质酶重组诱导伸长。分析ENG对顶端和基部菌柄细胞壁预处理释放产物的差异，并与外切β-1,3-葡聚糖酶EXG作用对比，揭示灰盖鬼伞菌基部菌柄成熟细胞壁扩张性的丧失是由于β-1,6-分支β-1,3-葡聚糖在基部更多积累及其分支交联所引起。采用浓碱高压蒸汽处理菌柄细胞壁碱不溶组分将几丁质转化为壳聚糖，用稀醋酸提取多糖组分，经分子大小排阻层析分析显示，菌柄细胞壁中几丁质主要和葡聚糖相交联形成复合物；大部分几丁质-葡聚糖复合物在细胞壁中呈游离状态，少部分与细胞壁基质多糖进一步交联；菌柄基部几丁质-葡聚糖复合物与基质多糖交联程度与顶端菌柄相比增强,支持基部菌柄成熟细胞壁扩张性的丧失是由于β-1,6-分支β-1,3-葡聚糖进一步积累及其分支交联所引起。另外，在开展细胞壁成熟作用关键重构酶基因表达调控的研究时，意外发现双干扰一种调节内切β-1,3-葡聚糖酶表达的转录因子CcnsdD2/nsdD1，会导致C. cinerea光诱导的原基和子实体形成缺失，揭示了CcNsdD2调节C. cinerea在光或黑暗条件下发育命运的分子机制。