金针菇菌柄细胞壁伸长作用的分子机制研究

子实体菌柄细胞伸长生长机理目前流行水解酶学说，水解酶降解作用使细胞壁持续松弛扩张，解除了细胞壁对细胞生长的束缚，使新合成的壁物质掺入到壁中。但近来研究发现，高等植物细胞壁伸长生长依赖一种细胞壁扩张蛋白expansin，其作用机制不是通过水解作用，而是通过破坏细胞壁中纤维素及其它多糖成分之间的氢键，使细胞壁松弛扩张。在前期预研中，我们首次发现金针菇子实体与高等植物细胞壁一样，存在着酸性伸长生长特性，并分离纯化到一个蛋白质，以非水解作用的方式诱导离体灭活的子实体菌柄细胞壁伸长，提示伞菌子实体菌柄细胞壁伸长生长作用机理与高等植物类似，尽管两者细胞壁的化学组成和结构非常不同。本课题以此为基础，研究金针菇菌柄细胞壁伸长生长特性；分离、纯化金针菇细胞壁扩张蛋白；扩张蛋白基因克隆和重组表达；研究扩张蛋白酶学性质及其菌柄细胞壁化学组成，阐明金针菇菌柄细胞壁伸长生长的分子机制。

伞菌子实体菌柄细胞伸长生长机理以往流行水解酶学说。近来研究发现，高等植物细胞壁伸长生长依赖一种细胞壁伸长蛋白，不是通过水解作用，而是通过破坏细胞壁多糖成分之间氢键，使细胞壁扩张。本课题研究金针菇菌柄伸长生长特性及细胞壁扩张蛋白，阐明细胞壁扩张作用机理。(1)研究表明，金针菇离体菌柄细胞壁存在酸诱导扩张活性，细胞壁扩张活性沿菌柄顶端到基部呈梯度分布,加热可灭活细胞壁扩张活性。由于金针菇菌柄最大伸长生长区域仅顶端1-2mm区域，且伸长蛋白含量低，难以从中分离纯化，故从真菌细胞壁破壁酶蜗牛酶中分离纯化获得一个菌柄伸长蛋白，在酸性下诱导菌柄细胞壁扩张。但不水解多糖、蛋白质和金针菇细胞壁，为非水解作用机制诱导菌柄细胞壁伸长。(2)通过筛选，发现灰盖鬼伞菌菌柄最大伸长生长发生在菌柄顶端菌盖内的9mm区域，而基部及其膨大区域不伸长，离体菌柄细胞壁活性大小分布与伸长生长区域的分布相一致，是一种研究菌柄伸长作用的极好材料。菌柄细胞壁扩张活性呈酸依赖性，分为一个非蛋白质介导的短期扩张作用和一个蛋白质介导的长期扩张作用。蜗牛expansin like protein 可以重组热灭活菌柄细胞壁长期扩张作用。(3)发现菌柄快速伸长顶部区域，细胞壁几丁质微丝横向紧密排列，有助于微丝之间的相互分离，新合成几丁质插入。随着细胞壁成熟，沿菌柄顶部到基部，细胞壁表面颗粒和无定形物质逐渐沉积，微丝和细胞壁基质的组成和交联逐渐发生改变，引起细胞壁硬化，细胞壁伸长作用停止，揭示了菌柄不同区域伸长生长和细胞壁扩张活性差异的结构基础。(4)从鬼伞菌盖提取液中分离纯化获得四个葡聚糖水解酶，beta-glucosidase, beta-1,3-glucosidase, exo-beta-1,3-glucanase 和endo- beta-1,3-glucanase,这些酶协同作用水解真菌细胞壁骨架成分beta-1,3/1,6-glucan。紫外诱变获得了一株非自发水解突变株, 葡聚糖水解酶活性明显下降，而几丁质酶和蛋白酶水解活性并没下降，在43个葡聚糖酶基因中，仅有上述4个葡聚糖酶基因连同另一个葡聚糖酶基因高表达, 揭示葡聚糖水解酶在菌盖自发水解过程中起主要作用。(5)获得一种灰盖鬼伞细胞壁蛋白，能重组热灭活的菌柄细胞壁长期伸长活性，后续研究工作2015年获得了国家自然科学基金项目资助。