DAGAT基因在三角褐指藻储存油脂合成中的功能及对环境因子应答研究

二酰基甘油转移酶（DAGAT）是细胞最终导致贮存油脂（三酰基甘油，TAG）合成的关键酶。海洋微藻是国内外研究生物能源及特殊脂肪酸来源的热点研究对象，三角褐指藻既有较高TAG含量，也有较高长链多不饱和脂肪酸（LCPUFA）含量。本项目拟以能规模化养殖的海洋微藻、三角褐指藻合成TAG所需的DAGAT基因为研究对象，通过分子克隆并构建该基因的转基因酵母及进一步在三角褐指藻中对该基因进行反义RNA和过量表达而系统进行该基因在三角褐指藻TAG合成中的生物学功能研究，揭示三角褐指藻DAGAT 与其储存较高含量EPA 间的关系；弄明白DAGAT 活性是否与藻细胞积累TAG数量相关联的科学问题；解决环境因子对藻细胞油脂含量的影响是否与对DAGAT 转录调控的影响相偶联的科学问题。以期揭示藻类富集LCPUFA 和积累TAG 的分子机理，为今后构建高LCPUFA 或高TAG产量的海洋工程微藻提供科学依据。

海洋微藻是国内外生物能源研究的重要对象，本项目以能规模化养殖的三角褐指藻合成TAG 所需的DAGAT基因为研究对象，通过生物信息学及RACE技术克隆到了三角褐指藻的二酰基甘油转移酶的cDNA序列；利用所得到的二酰基甘油转移酶cDNA序列构建反义RNA和反向互补RNA载体，利用RNA干扰技术（RNAi）鉴定了该基因的功能；并进一步探讨了铁、硅及外源脱落酸对该基因表达及油脂含量的影响，并对这两部分的结果做了关联分析；最后通过基因工程技术在三角褐指藻细胞内过量表达了所鉴定的二酰基甘油转移酶基因。. 主要研究结果如下：⑴克隆到三角褐指藻二酰基甘油转移酶全长cDNA序列（序列号为JF828904），且将其与全基因组序列中相应的基因序列比较发现其含有两个内含子，其编码框大小为1587bp编码528个氨基酸；⑵ 采用RNAi技术鉴定该编码基因功能，构建RNAi载体干扰了目的基因的表达（最高的干扰效率达85.5%，其平均干扰效率为50%左右），相应细胞的油脂含量明显降低，这就说明克隆所得的基因为二酰基甘油转移酶基因，并且在细胞油脂积累中发挥了重要的作用；⑶通过探讨铁、硅及脱落酸对三角褐指藻二酰基甘油转移酶基因及油脂含量的影响，得出：①在较低的铁离子浓度范围内(0-11.64ummol/L) PTDAGAT基因的表达和细胞的含量随其浓度的升高而升高，但过高铁离子的浓度(46.57μmol/L)同时抑制了PTDAGAT基因的表达及油脂积累；②微量的硅可以瞬时的促进三角褐指藻PTDAGAT基因表达及提高油脂的积累且提前了细胞大量积累的时期；③外源ABA对三角褐指藻二酰基甘油转移酶基因表达和细胞油脂积累有显著影响：在较低浓度的外源ABA（1-5mg/L）对PTDAGAT基因及油脂积累表现出明显的促进作用，其中1 mg/L的外源ABA表现出最为显著的促进作用，这些促进作用在PTDAGAT基因表达和细胞油脂积累完全一致；这部分的研究再次揭示了二酰基甘油转移酶对三角褐指藻油脂积累非常关键；⑷最后我们以克隆所得的基因为基础构建了高油脂含量的三角褐指藻遗传工程藻株，这是首次通过基因工程手段来提高三角褐指藻的油脂，为三角褐指藻开发作为生物柴油来源奠定了理论基础。