三角褐指藻蜡酯合成酶/二酯酰甘油酰基转移酶在油脂合成中的作用研究

The diatom Phaeodactylum tricornutum is a microalga with high containing of lipid. P. tricornutum oil contains large amounts of triacylglycerol (TAG) of total lipids under stress conditions, suggesting that the enzymes responsible for TAG formation are active in P. tricornutum. Diacylglycerol acyltransferase (DGAT) plays a pivotal role in TAG formation. There are seven proposed diacylglycerol acyltransferase genes found in P. tricornutum genome, three of which were confirmed for the functions. Recently our team found a novel gene in P. tricornutum genome which may encode a wax ester synthase/diacylglycerol acyltransferase (WS/DGAT). It is the first WS/DGAT described thus far from microalgae. It is urgent to know whether the gene could express active protein as a prokaryotic gene construct, whether the enzyme could enhance wax ester or TAG synthesis, and the relationship of this enzyme with the other DGATs in P. tricornutum..For these above questions, this project is going to testify P. tricornutum WS/DGAT-like gene function by expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae TAG-deficient mutant; meanwhile the expression pattern of this gene and the relationship with known DGATs in P tricornutum, will be conducted by real-time PCR; A mutant P. tricornutum with the WS/DGAT-like gene overexpression will be constructed for further confirmation of the WS/DGAT function.

三角褐指藻是一种高油脂含量的海洋单细胞硅藻，是目前研究微藻油脂合成途径的模式藻种之一。三角褐指藻油脂的主要成分是甘油三脂（TAG），二酯酰甘油酰基转移酶（DGAT）是TAG合成的限速酶，目前发现该藻含有多个的DGAT基因，但TAG合成机制尚不明确。申请人在三角褐指藻基因组上发现了一个可能编码蜡酯合成酶/二酯酰甘油酰基转移酶（WS/DGAT）的基因，这是在藻类细胞中发现的第一个WS/DGAT双功能酶基因。这种原核型结构的基因在三角褐指藻中是否能够表达并具有相应的功能？其表达对甘油三脂和蜡酯合成与积累有什么样的影响？该基因与三角褐指藻已知DGAT基因是否存在协同作用？.为了探明以上问题，本项目拟通过在缺陷型酵母中异源表达WS/DGAT基因，验证其功能；通过实时荧光定量法检测三角褐指藻中该基因的表达模式及与已知DGAT基因的相互关系，并通过构建过表达突变株进一步验证其在油脂合成中的作用。

本项目从三角褐指藻的全基因组序列出发，发现了一种可能的双功能酶：蜡酯合成酶/二脂酰甘油酰基转移酶，通过序列分析、体外功能检测以及胞内过表达实验对该酶的功能和活性进行了研究。通过与已知DGAT1、DGAT2、DGAT3和WS/DGAT的蛋白序列进行比对分析，发现PtWS/DGAT与已知的不动杆菌 （Acinetobacter sp. ADP1）等多条WS/DGAT聚到一簇。继而克隆了三角褐指藻的PtWS/DGAT的cDNA片段并导入油脂缺陷型酵母H1246中，利用尼罗红染色法和薄层层析检测均发现H1246-PtWS/DGAT的脂质含量高于H1246- pYES2，并且在H1246-PtWS/DGAT中出现了油脂及微量蜡酯，验证了该酶的双功能酶特性。继而通过比较突变株中油脂和蜡酯的含量以及脂肪酸组成，推测此双功能酶对二脂酰甘油酰基转移酶活性高于蜡酯合成酶，且对饱和脂肪酸C16:0和C18:0具有底物偏好性。通过检测在三角褐指藻积累脂质过程中，双功能酶PtWS/DGAT与其他DGATs的表达谱，发现三角褐指藻中三种DGATs（PtDGAT1，PtDGAT2B和PtWS/DGAT）的表达量分析发现，PtDGAT1的表达量最高，PtDGAT2B次之，推测PtDGAT1是三角褐指藻DGAT的主要功能酶，PtWS/DGAT是辅助功能酶。在缺氮诱导脂质积累过程中，三种DGATs的表达量均大幅上升，对于脂质积累尤其是脂肪酸支链的变化有重要关系。为了进一步验证该酶在三角褐指藻中的功能，利用三角褐指藻内源调控序列PfcpA，PfcpB和TfcpA，以除草剂草丁膦抗性基因bar基因为筛选标记，构建了PtWS/DGAT的内源表达载体，继而利用基因枪转化法将PtWS/DGAT导入对数期的三角褐指藻中并筛选获得抗性突变株。该突变株的总脂、TAG含量较均有明显提高，并有微量蜡酯合成，证明了三角褐指藻中该酶的双功能酶特性。对PtWS/DGAToe和野生型三角褐指藻进行10L的扩大培养，发现PtWS/DGAToe的脂质合成性能依然高于野生型，这些结果表明PtWS/DGAT在胞内具有二脂酰甘油酰基转移酶和蜡酯合成酶的功能，并且PtWS/DGAToe可以实现稳定遗传。本课题发现了藻类中发现的第一个蜡酯合成酶/二脂酰甘油酰基转移酶，对揭示三角褐指藻乃至藻类的油脂合成机理具有重要价值。