衣壳蛋白关键氨基酸突变对食源性诺如病毒GII.17型流行性的影响及分子机制研究

Norovirus is an important microbial contaminant that causes food safety incidents such as shellfish, salads, and berries. The lack of animal infection models hinders its understanding, but the changes of receptor- binding function and immunogenicity of viral capsid protein are found to be important factors for its continuing epidemic. In recent years, a sudden outbreak of the non-epidemic norovirus GII.17 has attracted wide attention, but it is not clear how the key amino acid mutations on viral capsid protein of the new variant affect its epidemics. In this study, taken the reconstruction of the evolutionary process of GII.17 capsid proteins as the breakthrough point, the distribution and variation of key amino acids would be first explored by analyzing the differences of the new GII.17 variant, ancestral GII.17 variants and original GII.4 epidemic variants. Based on the preparation of the capsid proteins and antibodies of different GII.17 variants, the differences of their receptor- binding functions and immune cross-reactivities would be then investigated. Finally, a series of artificial key amino acid mutants on viral capsid would be rationally designed, and effects of these mutations on viral binding receptor function and immunogenicity would be resolved. The expected results will reveal the effect of variation of new GII.17 capsid protein on the virus epidemic and its molecular mechanism, which could improve the evolutionary theory of non-epidemic noroviruses and provide new ideas for rational design of virus control strategies.

诺如病毒是引起贝类、沙拉、浆果等食品安全事件的重要微生物污染物。动物感染模型的缺乏阻碍了对它的认识，但病毒衣壳蛋白结合受体功能和免疫原性的不断变化被发现是其持续流行的重要因素。近年来一种原非流行性诺如病毒GⅡ.17型的突然暴发引起了广泛关注，然而这种新现变异株衣壳蛋白上哪些位点突变对其流行性造成了怎样影响尚不清楚。本项目以重构GⅡ.17型病毒衣壳蛋白的进化过程为切入点，首先通过分析新现变异株、祖先株及原GⅡ.4型流行株的差异，探索关键氨基酸位点分布及变异特点；其次分别制备GⅡ.17型各类变异株的衣壳蛋白与抗体，考察其受体结合功能的差异与免疫交叉性变化；最后理性设计系列衣壳蛋白关键氨基酸突变体，解析关键氨基酸突变对病毒结合受体功能与免疫原性的影响。预期成果将揭示GⅡ.17型新现变异株衣壳蛋白突变对病毒流行性的影响及其分子机制，完善非流行性诺如病毒的进化理论，为理性设计病毒防控策略提供新思路。

诺如病毒是引起贝类、沙拉、浆果等食品安全事件的重要微生物污染物。作为单链正义RNA病毒，诺如病毒极易变异，具有具有丰富的遗传多样性，人源病毒已有近四十种基因型；不同基因型病毒呈现出不同的流行危害特征，其中 GII.4一直是近三十年来的主要流行基因型。然而，近年来一种原非流行性GII.17型诺如病毒的大规模流行引起了广泛关注，但其具体原因仍不清楚。基于以上科学问题，本项目在重构GII.17型进化过程的基础上，系统开展了其分子进化机制研究。首先，基于衣壳蛋白VP1的系统发育分析显示，GII.17型病毒可被分为四种变异株A~D，其中GII.17-D即为此次暴发的GII.17 Kawasaki 2014。接下来，通过杆状病毒表达系统制备了GII.17流行株的病毒样颗粒，电镜观察显示其大小约30nm，与PGM受体及A、B、AB、O型受体均能结合，但与非分泌型不结合。同时，采用原核表达系统制备了四种GII.17型代表株的衣壳P蛋白，并免疫动物制备了相应的单克隆抗体与多克隆抗体。在受体结合功能实验中，四种变异株均能结合O型受体且不与非分泌型受体结合，但GII.17-C和D相比对GII.17-A和B呈现出更强的A、B型受体结合能力，表明新流行株具有更广泛的宿主范围。在免疫原性方面，早期毒株GII.17-A和B的抗血清与新变异株GII.17-C和D的交叉反应性较强（OD450：0.80~1.16），而新现变异株抗血清与早期毒株的应答则明显减弱（OD450：0.26~0.56）；同时，中和阻断研究发现，早期毒株抗血清仅对自身受体结合呈现出抑制作用，对新现变异株并未造成影响，表明新变异株GII.17-C和D可通过抗原变异以逃避早期的群体免疫效应。此外，项目还成功验证了无细胞蛋白表达系统可用于表达病毒衣壳P蛋白，并通过对关键氨基酸的丙氨酸扫描突变以及回复突变等研究，确认了特异性单抗2D11的识别表位（295-300aa）。该表位在病毒进化过程中，每隔一段时间即会出现，随后消失，这可能与此次GII.17-D的突然暴发相关。综上所述，本项目从病毒的受体结合能力以及免疫原性等角度，系统性揭示了新现变异株衣壳蛋白突变对病毒流行性的影响及其分子机制，完善非流行性诺如病毒的进化理论，从而为理性设计病毒防控策略提供新思路。在本项目执行期，以上工作发表学术论文6篇，申请国家发明专利6件，培养研究生3人。