食源性诺如病毒小衣壳蛋白VP2在病毒样颗粒体外表达中的调控作用

Norovirus is the major cause of acute gastroenteritis throughout the world and often cause acute food safety and pulblic health incidents. Exogenous expression of capsid protein become an important tool for norovirus study because the lack of culture system of norovirus in vitro to date. Exogenous expression of the major capsid protein VP1 could form virus like particles (VLPs) in vitro automatically. The VLPs are very close to wild norovirus particles in the morphology, structure and immunogenicity and can be used as an “alternatives” of wild norovirus in research. Some studies showed that minor capsid protein VP2 can regulate the expression quantity of VP1 and keep homogeneity of VLPs. However, at present, the function of the minor capsid protein VP2 are not well known, and the relationship of VP2 and VLPs is worth to study further. Therefore, on the basis of the previous study, we first obtain two types of VLPs (include VP2 or not) through recombinant baculovirus. Second, we analyze how do VP2 regulate the protein expression of VLPs. Third, through receptor binding assays, we probe into how do VP2 affect the receptor binding ability of VLPs. Forth, we analyzed the structure changes of two VLPs under different physical and chemical conditions by circular dichroism, dynamic light scattering and transmission electron microscopy. Consequently, we want to reveal the regulation of VP2 to VLPs from the three aspects of protein expression, structure and function. The study will provide a good basis for the mechanism of norovirus stability in natural conditions, and then prevention and control of norovirus.

诺如病毒是世界范围内流行性胃肠炎的主要病原，常引起暴发性食品安全与公共卫生事件。由于至今仍无成熟的体外培养系统，衣壳蛋白的外源表达成为研究诺如病毒的重要手段。诺如病毒主要衣壳蛋白VP1经杆状病毒表达后自组装的病毒样颗粒在结构和功能方面类似野生病毒，可作为其研究的“替身”。研究发现小衣壳蛋白VP2可以调控VP1的表达量及维持病毒样颗粒的均一性，但VP2对VP1和病毒样颗粒具体的影响和作用还有待深入研究。本项目在前期研究基础上，通过制备含VP2蛋白和不含VP2蛋白的两种病毒样颗粒，分析VP2对病毒样颗粒蛋白表达量的调节作用和机理；通过受体结合实验探讨VP2对病毒样颗粒结合受体能力的影响；用圆二色谱等分析不同理化因素作用下两种病毒样颗粒的结构变化，旨在从蛋白表达-功能-结构三个层面揭示VP2蛋白对病毒样颗粒的调控作用，明晰VP2对诺如病毒在自然条件下稳定存在的作用和机理，为防控该病毒奠定基础。

前期研究发现诺如病毒的小衣壳蛋白VP2可以调控VP1的表达量及维持病毒样颗粒的均一性，但VP2对VP1和病毒样颗粒具体的影响和作用还不明确。本研究在国家自然科学基金的资助下，主要从蛋白表达-功能-结构三个层面揭示VP2蛋白对病毒样颗粒的调控作用，明晰VP2对诺如病毒在自然条件下稳定存在的作用和机理，为防控该病毒奠定基础。主要完成以下工作：.1．构建表达了NoV VP1蛋白、VP2蛋白的重组杆状病毒AV-VP1和AV-VP2，通过Western blotting与间接免疫荧光证实VP1与VP2在昆虫细胞sf9中获得成功表达；用VP1重组杆状病毒感染sf9细胞，或用VP1和VP2的重组杆状病毒同时共感染sf9细胞，获得了不含VP2蛋白的病毒样颗粒VLP，以及含有VP2蛋白的病毒样颗粒VLPs，利用透射电子显微镜观察到两种病毒样颗粒的存在，并通过CsCl密度梯度离心分离和纯化。 .2．通过圆二色谱仪分析分别经不同pH和不同浓度臭氧水处理后的两种病毒样颗粒的二级结构变化。结果表明，在酸性及中性条件下，即pH2-7处理后，VLP及VLPs的二级结构变化不明显；但在偏碱性的的条件下，即pH8磷酸盐缓冲液处理后的VLP二级结构明显大于VLPs的结构变化，说明碱性条件下VP2可以在一定程度上稳定病毒样颗粒的二级结构。将两种病毒样颗粒分别用不同浓度的臭氧水处理后发现，随着臭氧浓度的增大，VLPs二级结构的变化小于VLP的变化，说明VP2可以在一定程度上稳定VLP在臭氧水中的二级结构。.3.分析了VP2蛋白对于病毒样颗粒蛋白表达量的调节作用，结果表明VP2蛋白可以正向调节病毒样颗粒的表达量；利用 ELISA 唾液结合实验分析两种病毒样颗粒与与不同型别组织血型抗原的亲和性。结果表明，两种病毒样颗粒均能与A型，B型，AB型及O型分泌型结合，而与O型非分泌型不结合，与B型、AB型的结合力稍强于与A型、O型分泌型和非分泌型。.4.项目发表和投稿文章4篇，2篇中文核心（已刊出），2篇SCI（审稿中），授权2项国家专利。