食源性诺如病毒次衣壳蛋白VP2在与主衣壳蛋白VP1互作中的共进化机制

Norovirus is an important microbial pollutant that causes food safety incidents in the world. The rich genetic diversity is the key factor for its continuous transmission. The minor capsid protein VP2 was one of the major variable proteins in the viral genome and plays an important role in stabilizing the virus-like particle by interaction with the major capsid protein VP1. However, it is unclear how two capsid proteins interact and whether there is a co-evolutionary relationship in the evolution of the virus. In this study, VP2 would be taken as the research object. First, we will reconstruct the evolution process of noroviruses based on VP2, calculate the distributions of SAP at the genogroup / genotype levels, analyzed the genetic diversity and recombination of two capsid proteins, and predict interaction sites and their variation characteristics, which would establish a novel VP2-based norovirus classification system. Second, two major capsid proteins of the major genotype virus would be gene synthesized and expressed exogenously. We will investigate the effect of VP2 on the virus-like particles expression and stability, and test their interaction by using protein-interaction techniques, such as the yeast-two-hybrid system. Finally, a VP2 mutant library based on genotype-specific SAP would be constructed. Based on the comparison of interaction with major capsid protein VP1 of different genotypes, we will verify the variation mechanisms of key amino acid sites in VP2 during virus evolution. The expected results will reveal mechanisms of interaction and co-evolution of norovirus major and minor capsid proteins, which could improve their evolutionary theory and provide new ideas for rationally design of virus prevention and control strategies.

诺如病毒是引起食品安全事件的重要微生物污染物，丰富的遗传多样性是它持续传播的关键因素。次衣壳蛋白VP2是诺如病毒基因组上编码的主要易变蛋白之一，它能够通过与主衣壳蛋白VP1互作而稳定病毒样颗粒。然而，两种衣壳蛋白如何发生互作、在病毒演化中是否存在共进化关系等问题仍不清楚。本项目以VP2为对象重构病毒进化过程，计算基因群/基因型等水平上的SAP分布，解析两种蛋白多样性差异与重组情况，预测互作位点及其变异特点，建立起基于VP2的诺如病毒分型体系；基因合成并制备主要基因型病毒的两种衣壳蛋白，考察VP2对病毒样颗粒表达及稳定性影响，并采用酵母双杂交等方法验证其互作关系；构建基于基因型特异SAP的VP2突变体库，通过与各型别病毒VP1的互作比较，验证进化中VP2上关键位点的变异规律。预期成果将揭示病毒主次衣壳蛋白的互作机理及共进化机制，完善诺如病毒分子进化理论，为理性设计病毒防控策略提供新思路。

食源性诺如病毒是引起全球引起贝类、浆果、沙拉等多类食品安全事件的重要微生物污染物，丰富的遗传多样性是该病毒持续传播的关键因素。主衣壳蛋白VP1是影响诺如病毒的结合受体能力和免疫原性的重要蛋白，而次衣壳蛋白VP2是诺如病毒一种主要易变异蛋白，它能够通过与主衣壳蛋白VP1互作从而稳定病毒样颗粒。本项目以食源性诺如病毒的次衣壳蛋白VP2为研究对象，通过重构出基于VP2基因的病毒进化过程，并筛选获得人源诺如病毒常见基因型代表株序列；借助杆状病毒表达体系制备构建诺如病毒病毒样颗粒蛋白库，并对其免疫原性和受体结合能力进行了系统评价。接下来，选取重要基因型GII.4和GII.17型等，制备了不含VP2蛋白的病毒样颗粒VLP和含VP2蛋白的病毒样颗粒VLPs，并发现了主次衣壳蛋白VP1与VP2共转染后蛋白表达量均高于单独转染，且含有VP2蛋白的病毒样颗粒VLPs具备更稳定的免疫原性及受体结合功能。然后，以诺如病毒常见基因型代表株毒株为对象，分别构建了酵母双杂交载体pGADT7-ORF2和pGBKT7-ORF3进行互作研究。结果显示，不同毒株之间主次衣壳蛋白存在一定相互作用，其自身蛋白的相互作用显著强于不同毒株间（p=0.002）。在此基础上，针对重要基因型GII.4，选择了从出现至今的7株代表株，通过酵母双杂交实验发现，在GII.4流行变异株中VP2与VP1存在相互作用，并且时间相邻毒株间的相互作用明显强于非相邻毒株(P=0.0001)，提出了GII.4型诺如病毒次衣壳蛋白VP2与主衣壳蛋白VP1呈现出基于相互作用的共进化过程。此外，通过突变体实验挖掘了VP2上的具有相互作用的关键区域（131~160和171~180）。类似的，针对毒重要基因型GII.17，发现四个代表株的主衣壳蛋白VP1与各自配对的次衣壳蛋白VP2交叉相互作用，且GII.17-D变异株次衣壳蛋白VP2上的174-179aa是其与主衣壳蛋白VP1的关键互作位点。综上所述，本项目从次衣壳蛋白VP2的角度完善了食源性诺如病毒衣壳蛋白的分子进化理论，为理性设计病毒防控策略提供重要的作用靶点以及新思路。在本项目执行期，发表相关学术论文29篇，申请国家发明专利5件，培养研究生8人。