甜菜夜蛾酪氨酸羟化酶基因启动子特殊二级结构对基因转录水平的影响

Spdoptera exigua (Hübner) is the important polyphagous pest, which showed resistance to many kinds of insecticide. We need to study the physiologically important gene to be the new insecticide target to solve the resistance problem. Tyrosine hydroxylase is the rate-limiting enzyme in catecholamine biosynthesis. In insect, TH contributes to the humoral immunity and behavior coordination. In the previous study, we predicted some G:C-rich regions adopt G-quadruplex secondary structures in the proximal promoter of Th from the beet armyworm, Spodoptera exigua. The formation of G-quadruplex will inhibite the Th transcription to disturbe the physiological activity of S. exigua. Following the prediction, in this project, we will identify the G-quadruplex, i-motif and hairpin secondary structures in the Th promoter by circular dichroism and electrophoretic mobility shift assays, and study the binding ability of small molecule to G-quadruplex or i-motif through UV spectroscopy and fluorescence resonance energy transfer assay. Finally, we will study the transcriptional regulation of Th under the formation and dynamic transformation of those special secondary structures in insect cells and beet armyworm larvae, respectively. With this project, we will illustrate the special secondary structures in the Th promoter of beet armyworm and their role in transcriptional regulation. We will provide new insight in developing new pesticide targeting and regulating Th promoter region.

甜菜夜蛾Spodoptera exigua（Hübner）是重要的多食性农业害虫，已对多种农药产生抗性，需要研究其生理过程中的重要基因作为新农药靶点来缓解抗性。酪氨酸羟化酶（TH）是儿茶酚胺生物合成的限速酶，对昆虫体液免疫和行为协调产生很大影响，我们在甜菜夜蛾Th近端启动子区域发现可形成G-四链体的G富集序列，该结构的形成有望降低Th的转录而控制甜菜夜蛾的生理活动。本项目将采用圆二色谱、凝胶迁移滞后试验鉴定甜菜夜蛾Th启动子中的G-四链体、i-motif和发卡结构，通过紫外光谱和荧光共振能量转移试验测定小分子与G-四链体或i-motif的结合能力，最后分别在昆虫细胞和甜菜夜蛾幼虫中研究上述二级结构的形成及动态转化对Th启动子活性及基因转录水平的影响。本项目将探明甜菜夜蛾Th启动子中特殊二级结构以及它们如何影响基因转录水平的问题，为开发靶向调节酪氨酸羟化酶基因转录水平的杀虫剂提供研究思路。

发现新靶标是药物研究领域的源头创新，其中探索以核酸高级结构为杀虫剂靶标并进行药物设计是重要的研究方向。酪氨酸羟化酶是多巴胺生物合成的限速酶，与昆虫神经递质生物合成、表皮黑化和鞣化过程紧密相关。本研究在酪氨酸羟化酶的编码基因Th近端启动子区发现3条富含鸟嘌呤（G）的序列，采用圆二色光谱方法对发现的G-rich序列进行体外结构验证，证明TH PQS3-2形成单分子G-四链体，而TH PQS2和TH PQS3-3形成分子间G-四链体；双荧光素酶实验证明TH PQS3-2所在区域是Th基因启动子具有高活性所必须的，表明TH PQS3-2 G-四链体的形成可能参与基因转录水平的调节；TH PQS3-2可以显著增强植物源G-四链体配体化合物小檗碱的荧光，表明小檗碱可以与TH PQS3-2 G-四链体发生相互作用；将小檗碱添加到人工饲料中饲喂甜菜夜蛾3龄幼虫，可观察到甜菜夜蛾幼虫生长发育明显减缓，身体缩小且失去爬行能力，表明小檗碱具有抑制甜菜夜蛾幼虫生长发育的活性。以上结果表明，植物源G-四链体配体小檗碱有望通过靶向甜菜夜蛾Th基因启动子G-四链体TH PQS3-2而同时调节甜菜夜蛾行动及表皮形成过程。为评估植物毒素作为天然G-四链体配体的可行性，本项目对植物毒素棉酚、花椒毒素和单宁酸对甜菜夜蛾的适合度代价及对化学杀虫剂的耐受性进行了系列研究。研究表明，尽管棉酚和花椒毒素具有有望与G-四链体互作的结构基础，但由于它们会诱导甜菜夜蛾对菊酯类农药产生抗性，因此不能作为候选化合物。另一方面，研究发现植物次生代谢产物单宁酸可以对双酰胺类杀虫剂氯虫苯甲酰胺产生增效作用，单宁酸的增效作用体现在抑制甜菜夜蛾生长发育，显著降低存活率和繁殖率等方面。单宁酸可作为候选天然G-四链体配体开展后续研究。本研究发现的Th基因启动子的G-四链体结构属于G2-四链体，不同于广泛报道的G3-四链体。研究发现G2-四链体比G3-四链体对离子和小分子配体的浓度变化更加敏感，体现其具有更易被调控的特征。本研究为合理选择靶向昆虫核酸结构的植物天然产物作为新型杀虫剂先导化合物提供参考依据。