植物介导RNAi研究甜菜夜蛾生长发育关键基因的功能

本项目在对我国棉花虫害严重发生地区调研的基础上，以危害棉花重要害虫甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）为研究对象，选择甜菜夜蛾生长发育关键基因- - 蜕皮调节转录因子SeHR3作为靶标基因，通过构建超表达、反义和ihpRNA植物表达载体，建立和优化农杆菌介导的棉花转化体系，分别将其导入棉花基因组中，通过分子鉴定检测靶标基因在棉花中的整合、转录及表达情况。转不同构建模式棉花生测试验，选取不同龄期甜菜夜蛾幼虫，观察和记录其取食转基因棉花后的表型变化，推测实验结果，不同龄期甜菜夜蛾幼虫在取食转基因棉花表达SeHR3 dsRNA后，生长发育会受到明显抑制，并将可能引发蜕皮障碍等死亡表型。同时，利用Northern blot检测靶标基因SeHR3在棉铃虫体内的转录变化水平。本项目将在棉花中验证SeHR3基因是否可作为害虫生物防治的靶标基因及对其作用的分子机制进行探索性研究。

本研究在对我国棉花虫害严重发生地区调查基础上，以危害棉花重要害虫甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）为研究对象，选择甜菜夜蛾生长发育关键基因——蜕皮调节转录因子SeHR3作为靶标基因，通过构建超表达、反义和ihpRNA植物表达载体，建立和优化农杆菌介导的棉花YZ1遗传转化体系，分别将其导入棉花基因组中，通过PCR、RT-PCR分子鉴定及Southern杂交检测和鉴定了靶标基因在棉花中的整合、转录情况。再通过转不同构建模式棉花生测试验，选取不同龄期甜菜夜蛾幼虫，观察和记录其取食转基因棉花后的表型变化，实验结果表明，不同龄期甜菜夜蛾幼虫在取食转基因棉花表达SeHR3 dsRNA后，生长发育会受到明显抑制，体重较对照呈现显著性降低，并引发害虫蜕皮障碍等死亡表型。本研究同时利用现代高通量small RNA测序技术获得甜菜夜蛾幼虫全部的microRNAs，采用生物信息学软件和分析技术，选择与甜菜夜蛾生长发育密切相关的靶标基因对应的microRNA作为重点研究对象，人工合成其模拟物作为活性成分，通过饲喂甜菜夜蛾幼虫，使昆虫体内过表达Sex-miR4924，导致Sex-miR4924的靶标基因Chitinase1显著下降，这时甜菜夜蛾就不能正常生长发育，并将引发蜕皮障碍等异常表型，破坏了昆虫生长发育调控机制的平衡，从而实现了在甜菜夜蛾害虫生物防治中的应用。总之，本研究开展了在棉花中验证利用害虫SeHR3基因来防治自身的生物学试验和利用甜菜夜蛾自身microRNA来抑制自身生长发育关键基因的生物学功能，都可作为棉区害虫甜菜夜蛾等鳞翅目害虫生物防治的抗虫基因工程提供很好的参考价值和理论依据。