藏药“阿夏塞尔郡”保肝作用药效物质及其作用机制研究

Oxidative stress is the collective pathophysiological mechanism of many hepatopathies. Our previous studies have found that the flavonids of Pyrethrumta tsienense (Bur. et Franch. ) Ling can protect the injured liver by antioxidation, its mechanism may be related to expression and regulation of endogenous antioxidant enzymes, enhance liver tissue against ROS scavenging ability. Therefore, based on the isolation and identification of chemical constituents and total flavonids fraction, guiding with anti Oxidative stress activity, the active components of PTF is prepared and clarified by LC/MS, to reveal its active bases. Meanwhile, in rat models and cell models, the systematic studies of active components on Nrf2/Keap1-ARE-antioxidase signaling pathway and its time regularity will be performed to reveal its mechanism of antioxidant hepatoprotectivity.

氧化应激是多种肝病发病的共同病理生理基础，与多种肝脏疾病的发生密切相关。课题组前期研究结果表明，阿夏塞尔郡可能通过其有效物质-黄酮类成分的抗氧化活性实现其对肝损伤的保护作用，其抗氧化保肝的作用机制可能为调控内源性抗氧化酶的表达，增强肝组织对有害自由基的清除能力。因此，本项目拟以氧化应激肝损伤保护作用为指导，在化学成分、总黄酮有效部位系统分离及结构鉴定的基础上，采用LC/MS等方法，解析、辨认有效部位的组成成分，明确其药效物质基础；采用氧化应激肝损伤动物模型和细胞模型，观察有效部位对内源性抗氧化系统"Nrf2/Keap1-ARE-抗氧化酶"通路关键信号分子的调控作用及其时间规律，从分子水平系统阐明"阿夏塞尔郡"肝损伤保护作用的药效物质及作用机理。

本项目在藏医药理论的指导下，对藏药“阿夏塞尔郡”保肝药效物质和作用机制进行了研究。完成了“阿夏塞尔郡”中总黄酮有效部位制备，运用UHPLC-Q-TOF-MS/MS液质联用谱技术，以及与前期研究分离得到的化合物进行比对，对“阿夏塞尔郡”中总黄酮有效部位的组成成分进行解析、辨认，明确“阿夏塞尔郡”药材有效部位的物质基础为黄酮类成分，证实“阿夏塞尔郡”中总黄酮部位对CCl4致大鼠肝损伤模型具有保护作用，并阐明了其作用机制与调控抗氧化有关的信号通路Nrf2-ARE以及下游相关基因和蛋白的表达水平有关。.对分离得到的黄酮类化合物，采用DPPH和ABTS清除自由基法进行体外抗氧化活性测试，结果表明，打箭菊中的黄酮均具有较明显的抗氧化活性，能够有效的清除自由基，特别以木犀草素为母体的一系列化合物（由于结构中邻位酚羟基的存在）均能够有效地清除ABTS+•和DPPH自由基，据此可以推断打箭菊发挥药效物质基础，为进一步阐明打箭菊具有预防氧化性肝损伤的作用机制提供理论依据。.对“阿夏塞尔郡”中总黄酮部位分离得到的黄酮类化合物在CCl4致大鼠肝细胞氧化应激肝损伤模型上进行保肝活性测试，结果表明苜蓿素、木犀草苷均能显著降低模型组细胞上清液中升高AST、ALT含量，且SOD含量及MDA含量趋近正常水平(P<0.01)；同时，苜蓿素、木犀草苷均能调控模型组异常的Nrf2-ARE信号通路下游相关基因和蛋白水平。“阿夏塞尔郡”中总黄酮部位对CCl4致大鼠肝损伤模型具有保护作用，并阐明了其作用机制与调控抗氧化有关的信号通路Nrf2-ARE以及下游相关基因和蛋白的表达水平有关。.在完成项目研究任务的同时，进一步拓展的研究工作：采用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱和圆二色谱法对“阿夏塞尔郡”中总黄酮部位中主要的四个黄酮类成分进行与人血清白蛋白（HSA）之间的相互作用的研究，结果表明，以上四个黄酮小分子对HSA分子的二级结构都有不同程度的影响，但影响不大。为探明“阿夏塞尔郡”中主要黄酮在体内运输的作用机制提供一定的理论依据。.本项目已基本完成了预期的考核指标。截至2018年12月，在国内外核心期刊已发表研究论文全文4篇，其中SCI收录2篇；培养硕士研究生1名，项目执行期间申请国家发明专利1项。