基于胆固醇代谢调节促进效应T细胞抗肿瘤的崖豆藤中活性物质的发现，作用机制及构效关系研究

Immune checkpoint inhibitors has recently been demonstrated to have notable effects on treating a variety of cancers, but its objective response rate needs to be further improved, only 20-30%. It is therefore of great clinical interest to develop other therapies combined with immune checkpoint inhibitors to potentiate the antitumour activity of CD8+T cells by modulating different pathways. The up-regulation of cholesterol in cell membrane is one of the ways to improve the activity of CD8+T cells. In the preliminary study, it was found that Griffinone B (GB) could up-regulate cholesterol in the plasma member, promote the activation of CD8+T cell and synergize with PD-1 antibody. Based on the preliminary study, we will reveal the underlying mechanism that GB could up-regulate cholesterol based on the detection of plasma membrane cholesterol, qRT-PCR analysis of cholesterol metabolism related mRNA and the relationship between the cholesterol transformation related protein ACAT1 and GB. Furthermore, we will analyze the effect of GB to the downstream TCR signaling pathways and on the formation of TCR and microclusters of the immune synapse with N-STORM and TIRFM method and verify its combination effect with PD-1 antibody in vivo. Finally, we will obtain high activity derivatives based on GB according to the initial structure activity relationship by the separated compounds as well as the docking results on ACAT1 through the syntheiss and structure activity relationship research. This study will lay the foundation for the design and development of GB as a leading compound for the activation of CD8+T cells.

免疫检验点抑制剂在多种肿瘤治疗中取得成功，但有效率仅有20-30%。研究针对调节CD8+T细胞活性的通路并促进免疫检验点抑制剂作用是目前研究的重要方向。上调细胞膜胆固醇是提高CD8+T细胞活性的思路之一。前期研究表明Griffinone B（GB）具有通过上调胆固醇促进CD8+T细胞激活增效PD-1抗体的作用。本课题拟通过对细胞膜胆固醇的检测、生物代谢相关mRNA分析以及对胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)和GB的关系等研究揭示GB上调胆固醇的作用机制并进一步分析TCR下游信号通路，结合N-STORM和TIRFM阐释GB对TCR microclusters及免疫突触形成的影响，并在体内验证其联用PD-1抗体的效果；基于前期分离化合物初步的构效关系及和ACAT1分子对接结果，通过合成及构效关系研究获得高活性衍生物。该研究将为以GB为先导化合物用于活化CD8+T细胞的药物设计和开发奠定基础。

在肿瘤免疫中，免疫系统识别并清除肿瘤细胞从而抑制肿瘤的发生发展，但肿瘤细胞可以通过免疫逃逸而逃脱免疫系统的识别和杀伤，从而实现恶性增殖。效应T淋巴细胞（CD8+T细胞）作为肿瘤免疫中的主要执行者，受到许多协同刺激分子和抑制性分子共同调节。Acat1是编码胆固醇酯酶的关键基因，其编码的胆固醇酰基转移酶1（ACAT1）是细胞内唯一催化游离胆固醇与长链脂肪酸连接形成胆固醇酯的酶，它能将游离胆固醇转化为胆固醇酯储存备用对于调控胆固醇的胞内平衡有重要作用。胆固醇是膜脂质的主要组成成分，目前已有研究表明胆固醇能促进T细胞受体（TCR）簇和T细胞免疫突触形成活化T细胞发挥效应功能。本项目首先以崖豆藤活性化合物为出发点富集了系列崖豆藤来源的化合物，并建立了基于NBD-胆固醇的ACAT1抑制剂的筛选模型，通过观察荧光获得了对ACAT1有较好抑制活性的苗头化合物，并以此为结构基础上合成了一系列化合物，进一步筛选出具有良好的ACAT1抑制活性的化合物A2。体外实验中，发现化合物A2具有明显的抗人源黑色素瘤A375和鼠源黑色素瘤B16F10细胞活性，抑制了黑色素瘤的增殖，诱导了其凋亡。同时通过药物亲和力反应目标稳定性实验（DARTS）和热移位实验（TSA）来发现A2能抑制蛋白酶和高温所导致的ACAT1蛋白降解，提示A2可能直接和ACAT1互助。进一步的分子对接发现A2苯并呋喃环上的氧原子与ACAT1蛋白氨基酸残基Trp420形成氢键相互作用；另一侧苯环上的三个氟分别与Phe479，Leu478以及分子内氢原子形成非经典氢键相互作用；此外该化合物骨架中的两个苯环分别与Tyr416，Trp420和Tyr413形成疏水相互作用。对接结果从理论上部分解释了A2具有较好活性的原因。体内实验中，我们建立了黑色素瘤B16F10移植小鼠模型评价化合物A2的抗黑色素瘤活性，单用PD1组或化合物A2组均体现不同程度的抗肿瘤效果，联合用药组无论从肿瘤体积还是瘤重上均体现优于单药的效果。综上所述，我们从崖豆藤中成功筛选出对ACAT1具有抑制活性的化合物A2，并且证实其在体内具有较好的抗肿瘤效果。项目执行期间发表标注科研论文4篇，培养硕士2名，博士2名。