AS关联基因的鉴定及其分子机制研究

本项目在申请者前期发现的强直性脊柱炎（AS）相关新基因(TNFα启动子变异)的工作基础上，拟应用基因组和功能基因组学技术，鉴定AS相关新基因，并着重研究TNFα启动子变异(-850 C/T)与AS关联的分子病理机制。拟在基因组水平上，采用病例对照设计，在包含TNFα基因的HLA III类区域约50kb中，进行有限片断的基因标记扫描，以澄清异位显性、连锁混淆和周边基因的交互作用。在转录水平上，探索有和无基因变异患者（经EBV转染永生化）B淋巴细胞在脂多糖刺激下的TNFα表达水平的变化，通过RNAi技术关闭其相关基因，在分子和细胞水平上确定TNFα基因变异的作用机制。并回到细胞和整体水平，研究TNFα变异在AS发生机制中的作用。结果有望揭示AS的发病机制，为AS的治疗提供标志物和新的药靶分子，同时为进一步研究TNFα在自身免疫疾病中的机制奠定了基础。

本课题原目标1）深入研究-850C/T常见变异影响TNF alpha表达的分子机理，2）通过高密度的SNP分型和测序进一步确定该58kb区段内AS潜在的病因学变异。然而，体外系列细胞实验研究，未能证明该变异具有影响TNF alpha表达的分子机制。提示-850C/T启动子变异可能仅作为一个分子标记，其周围可能紧密连锁着AS的病因学变异。于是，集中研究课题目标2）。结果，①经6个炎症相关基因BAT1,NFKBIL1,LST1,NCR1,LTA,LTB测序和33个tag SNP的精细定位，识别到LTA内含子上的常见变异rs909253是中国北方人群中与AS强关联（P<0.001)的候选基因。②接着利用下一代高通量测序AS患者的整个HLA III基因区，测序结果与Hapmap，1000 Genome Project和Ensembl数据库进行比对分析，初步筛选出12个在正常人群中频率低于5%，而在患者中频率高于20%的低频或罕见变异。③已经在中国北方三个群体（case=880,control=1398)中证实了了1个新的AS低频变异AIF1 g. 31583985C>T （P=10-37，OR=8.012，95%CI=5.503-11.665）。该低频等位基因T的携带可增加8倍的AS患病风险，提示该低频变异是AS发生的风险变异之一。AIF1 g. 31583985C>T的颠换，导致AIF isoform2 上第33位脯氨酸突变为硫氨酸，这一错义突变有可能通过改变AIF1的生物学功能增加AS的患病风险。