甘草查尔酮A诱导膀胱癌T24细胞凋亡机制研究

Licochalcone A (LA) is a flavonoid extracted from licorice root and exhibits strong anti-oxidative characteristics in chemical systems, however, in our previous study, we found that the ROS levels increased during LA-induced T24 cells apoptosis. Given that intracellular ROS level uptrend was relevant to LA-induced cell apoptosis, we changed the intracellular ROS levels by redox state modulators (NAC, CAT, Tiron and BSO). To insight the ROS-mediated signal pathway，we examined the expression of stress activated protein kinase (SAPK) phosphor-JNK、phosphor-p38、JNK、p38. To further confirm the LA-induced apoptotic signal pathway, we examined Cyt c, Caspase3, Caspase9, PARP, GRP78, GRP94, CHOP, Caspase7 and Caspase12 by western blot. Licochalcone B has a similar structure to A, but has less report about B, the comparative study will be conducted in one experiment. In this study, we will explore the relationship between the levels of ROS and apoptosis induced by LA and illuminate the possible mechanisms of LA-induced T24 cell apoptosis and then provide anti-tumor theoretical foundation for analog compounds. The results also provide proves for clinical antioxidant application, the compounds may be at risk of promote oxidation.

甘草查尔酮A在化学系统中有良好的抗氧化作用，但我们发现它在诱导T24细胞凋亡过程中，伴随着活性氧（ROS）升高。本研究拟采用药物单独或与氧化还原调节剂联用，人为干扰细胞内ROS水平，阐明细胞ROS水平和凋亡的关系。通过检测应激活化蛋白激酶、phosphor-JNK、phosphor-p38、JNK、p38表达变化，阐明查尔酮A诱导的T24细胞凋亡过程中ROS介导的信号通路。通过检测细胞色素c、Caspase3、 Caspase9、 PARP表达变化以及内质网固有伴侣蛋白GRP78、 GRP94、胁迫蛋白CHOP、Caspase7、Caspase12，确定凋亡具体通路。在动物模型上，对上述通路进行深入研究，并确定甘草查尔酮A的体内抑瘤效果。本研究可揭示查尔酮A诱导肿瘤细胞凋亡与ROS关系，弄清凋亡的分子机理，为类似化合物的抗肿瘤研究提供理论基础。还可提示此类物质抗氧化治疗可能存在促氧化风险。

研究甘草查尔酮A（Licochalcone A, LCA）诱导T24细胞凋亡过程中活性氧（ROS）、钙离子（Ca2+）变化与内质网、线粒体凋亡途径的关系，阐明甘草查尔酮A诱导T24细胞凋亡的机制。经甘草查尔酮A处理后的T24细胞出现明显的形态改变，细胞表现出染色体边集、核浓缩、核碎裂等典型凋亡形态学特征；细胞凋亡率随甘草查尔酮A浓度的增加而升高。甘草查尔酮A诱导T24细胞活性氧水平浓度依赖性升高的同时，引起细胞内T-SOD、CAT活性降低，GSH/GSSG比率降低。活性氧清除剂N-乙酰-半胱氨酸（NAC），可以通过降低细胞内ROS含量，增加GSH/GSSG比率降低细胞凋亡率；促氧化剂丁硫氨酸-亚砜亚胺（BSO）能通过增加细胞内ROS含量，加剧细胞凋亡；研究发现甘草查尔酮A诱导T24细胞内Ca2+上升，且具有浓度依耐性，细胞胞质内的Ca2+螯合剂BAPTA-AM促使细胞凋亡率增加，进一步研究发现甘草查尔酮A能诱导细胞线粒体膜电势降低，并呈现浓度依赖性。甘草查尔酮A调节凋亡相关基因Bax、Bim、Bcl-XL和Calpain 2等的表达，可诱导凋亡相关的信号分子Apaf-1、Caspase12、Caspase 9和Caspase 3活化从而诱导细胞凋亡。甘草查尔酮A具有诱导T24细胞凋亡的作用，其作用机制可能与调节细胞内氧化还原水平，及胞内钙离子浓度有关。诱导的T24细胞凋亡与细胞内ROS水平密切相关。LCA诱导胞质ROS升高，通过感应使线粒体内ROS增加，引起线粒体膜电势下降，最终激活由Caspase 3/Caspase 9介导的线粒体凋亡信号通路。除此之外，LCA诱导Ca2+介导的内质网凋亡通路也参与了LCA诱导的T24细胞凋亡。甘草查尔酮A可以抑制T24细胞增殖，并可将T24细胞阻滞在G2/M期，其S期阻滞可能通过下调CDK1，上调p21的mRNA和蛋白水平实现。甘草查尔酮A可抑制T24细胞糖酵解水平，其机制可能与抑制糖摄取，下调糖酵解的关键酶PK和LDH的活性有关。甘草查尔酮A可降低T24 细胞HIF1α水平表达，下调靶基因的水平可能与其抑制细胞周期和糖酵解有关。可以抑制T24细胞增殖，诱导细胞凋亡，其作用机制可能与调节细胞内CDK2活性有关。