基于解淀粉芽孢杆菌SQR9功能互补的植物益生菌群构建及共进化

Plant beneficial rhizobacterias (PBRBs) play a significant role in promoting plant growth and resistance to pathogens invading roots. At present, there are abundant resources of PBRBs at home and abroad. Most of the previous researches have focused on the mechanisms (i.e., plant-growth promotion and biocontrol of soil-borne diseases) of some certain PBRBs on single-strain level, and found that an organism faces trade-offs between immune function and other fitness-enhancing traits. Until now, there are few reports concerning the combined application or group behaviour among strains with different functions, especially those marker-less gene-edited ones. Bacillus amyloliquefaciens SQR9 is a PBRB strain, originally isolated by our group from a survived cucumber plant cultivated in a fusarium-wilt-infected region, which has been now commercially available in China due to its distinct plant growth stimulation effect and biocontrol of several phytopathogenic diseases. Our previous works have generated a huge marker-less mutant library for strain SQR9 containing those with enhanced mobility, proliferation, biofilm formation and anti-biotics production. The aims of the present work are 1) to develop an efficient functions complemental plant-beneficial microbial community by compounding the generated mutants and 2) to determine how the corresponding strains co-evolve during the co-cultivation and 3) to provide a theoretical basis for the construction of plant-beneficial microbial community.

根际益生菌在促进植物生长和抵抗病原菌入侵根系中起到关键作用，目前国内外已具有丰富的植物根际益生菌资源。过去的研究均是集中在单一种类功能菌水平上的促生和拮抗病原菌的机制，并且发现单种菌的不同功能表达存在此消彼长“Trade off”权衡效应。将不同功能根际益生菌进行科学组合的研究只是刚刚起步，并且关于共培养益生菌无痕敲除突变株对作物促生或拮抗能力的研究还未有报道。解淀粉芽孢杆菌SQR9是本实验室从黄瓜种植发病区的健康植株根际分离到的一株根际益生菌，在盆栽和大田试验中表现出显著的作物促生和生防效应。前期研究已构建菌株SQR9的无痕敲除突变株库，不同的突变株分别在细胞移动、增殖、成膜和分泌拮抗物质四个维度展现出显著的增强。本研究拟利用菌株SQR9的不同功能突变株构建解淀粉芽孢杆菌功能互补的益生菌群，并阐明其共进化机制，为植物根际益生菌群构建提供理论依据。

本研究拟利用菌株SQR9的不同功能突变株构建功能互补的益生菌群，通过测定菌群的功能指标及盆栽促生试验筛选益生菌群并分析其促生机制。研究结果如下：1）通过基因敲除、导入质粒等方法构建6株具有不同功能增强的SQR9突变子，与野生型SQR9共计7株菌。将上述7菌SQR9分成1、3、5、7不同菌种个数进行菌群组合，共计64组。将上述64组菌群处理进行传代培养，通过细胞数量、成膜能力、拮抗FOC、拮抗RS及基质试验的综合排名结果确定41组合菌群为促生效果最佳的益生菌群；2）盆栽试验分五个处理，分别为：①CK，对照处理（不施肥）；②CF，化肥处理（纯化学肥料）；③OF，有机肥处理（研制新型生物有机肥使用的腐熟有机肥）；④BF1，生物有机肥（添加△luxs突变菌株生物有机肥）；⑤BF2，新型生物有机肥（41号组合菌群）。在生物量方面，添加41组合菌群提高番茄植株地上部和地下部干鲜重效果最为显著，说明有机肥配施41组合菌群能够有效促进番茄的生长；土壤理化性质方面，与其他各处理相比，41组合菌群配施有机肥显著提高了土壤中有效钾含量；微生物群落细菌区系变化方面，41组合菌群配施有机肥处理与其他处理相比根际土壤细菌微生物群落之间有显著性差异，且在一定程度上增加了有利于作物生长的有益菌种；3）对41合菌群不同代数菌群进行突变菌株的分离，测定CK菌群（单独进化△luxS突变菌株）以及41组合菌群中分离的△luxS突变菌株在菌群进化过程中的功能变化。结果表明，41组合菌群细胞数量、产铁载体能力、产IAA能力、成膜能力、拮抗FOC、拮抗RS功能均稳定且优于CK菌群，但产芽孢能力低于CK菌群；4）根据功能指标测定结果，分别在第1代、50代、200代、400代的CK菌群和41组合菌群中各选取3株△luxS突变菌株进行重测序分析。结果表明，第400代41组合菌群中△luxS突变菌株的SNP变异数量最多，与CK菌群相比，差异基因主要存在于碳水化合物转运与代谢，辅酶转运与代谢，转录，复制、重组和修复，细胞壁、生物膜及生成等功能方面。