神经营养因子受体p75NTR在外胚间充质干细胞成牙分化与矿化的信号通路及调控机制研究

In the classical tooth development theory, the expression pattern of nerve growth factor receptor p75NTR, which is thought as specific markers of neural crest-derived ecto-mesenchymal stem cells (EMSCs), passes throughout the development and maturation of teeth. With our research progress in the odontogenic differentiation mechanism of EMSCs, more and more evidence shows that p75NTR participates in odontogenic differentiation and mineralization at different developmental stages of tooth through specific signaling pathways. On the basis of our previous research about biological function, signaling pathway and key regulatory proteins of p75NTR , the project aimed to clarify the spatiotemporal expression patterns of p75NTR; further explore the signal transduction and potential biological functions of p75NTR during development of tooth; elucidate the regulation mechanism of p75NTR signal on biological characteristics and relative signaling pathways of EMSCs during maturation and mineralization stage from the point of molecular biology. The finish of the topic will provide theoretical and technical platform for the comprehensive studies on tooth development and regeneration mechanism.

在经典的牙发育理论中，神经生长因子受体p75NTR的表达模式贯穿于牙齿发育和成熟分化的始终，并以神经嵴细胞特定标记物而存在。随着课题组对神经嵴源性外胚间充质干细胞（EMSCs）成牙分化机制研究的不断进展，越来越多的证据显示p75NTR在牙齿发育的不同阶段通过特定的信号通路参与细胞成牙分化和矿化。在前期对p75NTR的生物学功能、信号通路及关键调控蛋白研究基础上，通过本课题明确p75NTR在牙齿发育模式中的时空表达及功能作用；对p75NTR在成牙分化过程中信号转导和潜在的生物学功能进行深入探索；从分子生物学角度阐明p75NTR信号对EMSCs生物学特性的影响以及牙胚矿化期间相关信号通路的调控机制；本课题的完成也为全面研究牙齿发育及再生机制提供理论和技术平台。

在前期对p75NTR的生物学功能、信号通路及关键调控蛋白初步研究基础上，我们首先通过单细胞测序技术在单细胞分辨率下解析p75NTR-/-小鼠的基因表达差异，阐述p75NTR在颌面部组织发育中成骨/成牙作用、细胞间相互作用及p75NTR缺失对EMSCs的分化轨迹影响和基因变化特征；其次我们采用环状RNA分析颌突p75NTR -/-间充质干细胞的表达谱，从上游分子的角度探索矿化相关机制，阐明了环状RNA在p75NTR-/-间充质干细胞中的表达模式，筛选出了一些关键环状RNA及miRNA作为后续研究的关键分子。对于骨发育矿化及骨创伤修复方面我们也进行了形态与功能检测，我们检测了不同骨发育部位，不同发育时期小鼠骨量的动态变化趋势，通过全胚胎免疫萤光染色了解p75NTR及相关蛋白的表达区域及强度。制备颅骨缺损模型，观察颅骨自然修复情况与骨密度改变。证实颅骨修复过程中p75NTR可调控相关蛋白的表达差异，从而影响骨修复再生。我们最终选取NF-κB通路、rhoa/rock通路和JAK/STAT通路作为p75NTR在成牙/成骨分化的潜在信号通路。通过细胞划痕实验、Transwell侵袭实验、CCK8实验及ALP染色对分别p75NTR -/-间充质干细胞进行增殖能力、侵袭能力、迁徙能力和矿化能力分析，通过免疫荧光组化染色证实p65在小鼠胚胎脊柱发育的时空表达及强度差异；采用成牙/成骨诱导观察NF-κB 通路关键基因的表达差异，阻断NF-κB 通路观察对EMSCs 侵袭和增殖的影响，明确了阻断后成牙/成骨矿化基因DSPP、 DMP1及ALP的表达显着下调，我们还选取并验证了rhoa/rock通路，检测了成骨矿化诱导后通路相关蛋白与矿化关键蛋白的表达差异，观察rhoa、rock1、rock2及jnk的蛋白表达量差异，同时通过ALP染色进行验证。我们阻断rhoa/rock通路并观察细胞形态改变及流式细胞仪分析凋亡情况；在JAK/STAT通路方面，通过成骨诱导检测P75-/-间充质干细胞矿化相关标志物的表达情况改变，通过抑制JAK-STAT通路，观察和分析了成骨矿化能力改变与成骨基因的表达变化。综上所述，本课题全方位验证了p75NTR在颌突间充质干细胞成牙/成骨的调控作用及相关机制研究，也为牙组织及颌骨发育与再生的分子网络调控机制提供了理论基础。