T细胞活化和增殖共抑制双功能分子的构建及其在类风湿性关节炎实验治疗中的应用

生物制剂是治疗类风湿性关节炎的发展趋势。调控T细胞活化已成为新型抗风湿药的发展方向。CTLA4Ig能阻断CD28/B7通路、抑制T细胞活化而显示抗风湿作用。但IL2/IL2R传递的增殖信号可使T细胞对其产生抗性。为获更好效果，需同时抑制T细胞活化和增殖信号。项目前期发现，CTLA4Ig和抗IL2R抗体具协同免疫抑制效应。将CTLA4胞外段与抗IL2R α亚基的单链抗体共价连接，形成融合蛋白S25CT能抑制T细胞增殖，效果与CTLA4Ig和IL2R抗体联用相当。后续研究发现，将S25CT与抗体Fc段融合形成的S25CT-Fc具更强生物活性。本项目拟对S25CT-Fc分子结构进行优化，获得活性更强的融合蛋白；检测其对T细胞活化和增殖共抑制作用及体内抗类风湿性关节炎效果，明确机制，评价其作为新型抗风湿药的可能性。若获实施，可推出自主知识产权、新型高效免疫抑制分子，为治疗类风湿性关节炎提供新选择。

类风湿性关节炎的传统药物DMARDs存在起效缓、疗效低和毒性大等缺点，生物制剂的发展和应用极大地改善了这些缺点。T细胞活化是类风湿性关节炎发生发展的始动环节，调控T细胞活化是新型抗风湿药物的发展方向。T细胞活化共刺激通路抑制剂CTLA4Ig融合蛋白能阻断CD28/B7通路、抑制T细胞活化，已成为治疗类风湿性关节炎的重要方案。但IL2/IL2R传递的增殖信号可使T细胞对其产生抗性。同时抑制CD28/B7通路和IL2/IL2R通路，即CTLA4Ig和抗IL2R抗体具协同免疫抑制效应。因此，本项目设计将CTLA4和抗IL2R的抗体融合，以期构建能同时阻断CD28/B7和IL2/IL2R的双功能分子。我们首先将CTLA4胞外段与抗IL2R α亚基(CD25)的单链抗体Dmab(scFv)共价连接，形成双功能分子能抑制T细胞增殖，效果与CTLA4Ig和IL2R抗体联用相当。但是，该分子中各功能片段均为单价。为进一步提高其活性，我们设计在该分子中引入可能增加功能片段与靶分子亲和力的二聚结构域IgG1 Fc。用基因工程手段连接IgG1 Fc与功能片段Dmab(scFv)，在毕赤酵母表达系统中表达融合分子。SDS-PAGE和分子筛层析检测发现，IgG1 Fc的引入使单体形式的Dmab(scFv)形成了二聚体。功能检测表明，二聚体比单体分子对靶分子CD25亲和力和免疫抑制活性都增强。我们再将二聚结构域与Dmab(scFv)和CTLA4胞外段连接，构建二聚双功能分子，在毕赤酵母表达体系中表达，可获得预期分子量的表达产物。然而，可能由于分子量较大，在酵母表达系统表达困难，二聚双功能分子表达产量较低。虽然经过表达条件不断优化，仍达不到体内有效性检测所需用量。因此，我们又改用腺病毒表达体系，获得体内活性检测所需目标产物。目前，利用类风湿性关节炎小鼠模型评价其有效性的工作正在进行中。此外，我们还克隆了其它T细胞活化抑制分子功能片段基因，将其进行重组表达，检测发现这些重组分子具有剂量依赖的免疫抑制作用，为双功能分子的优化提供了更多选择。