基于microRNA-34a和let-7信号通路的双基因病毒治疗弥漫大B细胞淋巴瘤作用及机制研究

The abnormal expression of MYC gene about 20% in Diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) and it’s the main reason for refractory, recurrent. MYC and Bcl-2 signal pathway is a potential therapeutic target in DLBCL. It is reported that both miR-34a and let7 are low-expression in DLBCL and have the function to regulate MYC and cross-talk with MYC and miR-34a signal pathway, which would enhance MYC deregulation further. Therefore, restoration of these two miRNAs in DLBCL is a novel therapeutic strategy. Our previous studies have mastered the construction of chimeric oncolytic adenovirus technology，and demonstrated that oncolytic virus worked as an ideal transgene delivery system to restore miR-34a. This study is designed to carry out as following that: constructing a novel oncolytic adenovirus armed with miR-34a and let7; exploring its antitumor efficacy and the effect to block the cross-talking between miRNA and MYC/BCL2 pathway and to explore the deeper underlying molecular mechanism. This study will be significant on the application of miRNA replacement and oncolytic virus strategy in the DLBCL treatment, and has the potential theoretical and clinical application value in the research field of DLBCL.

MYC基因异常表达约占弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的20%，是DLBCL难治、复发的主要原因，所以MYC信号途径是治疗DLBCL的重要靶点。miR-34a和let7在DLBCL中低表达，可调控MYC基因，且MYC和miR-34a交互作用形成恶性循环，加重DLBCL的不良预后，因此如何提高这两种microRNA在DLBCL细胞的表达，是治疗MYC基因异常表达DLCBL的新方法。我们前期掌握了构建双基因嵌合型溶瘤腺病毒的技术；也构建了携带miR-34a的痘溶瘤腺病毒，并可以在多种血液肿瘤细胞高效表达miR-34。本项目拟开展下列研究：构建携带miR-34a和let-7的双基因嵌合型溶瘤腺病毒，研究其双靶向阻断-34a与MYC的交互作用，从而抑制MYC基因的异常表达；进一步阐明其分子机制。本研究结合microRNA替代治疗和溶瘤病毒治疗，以期在治疗MYC异常表达的DLBCL研究领域中获得创新

近年来溶瘤病毒治疗已成为恶性肿瘤治疗的有效新方法，溶瘤病毒更容易利用自身的特征和癌细胞与正常细胞的不同来做相应的改造，做到特异性靶向癌细胞。MYC基因异常表达约占弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的20%，是DLBCL难治、复发的主要原因，所以MYC信号途径是治疗DLBCL的重要靶点。miR-34a和let7在DLBCL中低表达，可调控MYC基因，且MYC和miR-34a交互作用形成恶性循环，加重DLBCL的不良预后，因此提高这两种microRNA在DLBCL细胞的表达，是治疗MYC基因异常表达DLCBL的新方法。本项目使用溶瘤痘苗病毒（OVV）表达mir34a和let7基因，使用溶瘤病毒与microRNA联合治疗策略，研究其双靶向阻断-34a与MYC的交互作用，从而抑制MYC基因的异常表达；进一步阐明分子机制。通过体外细胞生物学实验研究，首先空斑测定实验结果显示携带mir34a-IRES-let7或mir34a、let7基因不影响溶瘤痘苗病毒的细胞内复制，其次CCK8细胞毒性实验结果表明与搭载单基因及空载对照病毒相比，双基因新型溶瘤病毒OVV-mir34a-IRES-let7具有更强的杀伤淋巴瘤细胞效应，流式细胞实验证明OVV-mir34a-IRES-let7具有更显著的促凋亡效果；在靶向MYC和Bcl-2途径的分子机制研究中，本项目中组通过qRT-PCR检测研究重组溶瘤病毒处理后miR-34a、let-7下游信号FOXP1/Notch-1/Bcl-2/SIRT1以及c-myc/K-ras/HMGA2/lin28等癌基因和抑癌基因的表达调控情况，研究重组溶瘤病毒处理后bad、bax、caspase3等凋亡相关蛋白的表达，实验结果显示靶向miR-34a和let-7的确能显著阻断microRNA与MYC和Bcl-2途径的交互作用，从而获得更有效的对淋巴瘤细胞的杀伤效果。体内动物实验结果显示，与搭载单基因及空载对照病毒相比，双基因新型溶瘤病毒OVV-mir34a-IRES-let7具有更好的体内抗淋巴瘤效果，并显著延长小鼠生存期，肿瘤组织qRT-PCR实验再次验证了靶向miR-34a和let-7的确能显著阻断microRNA与MYC和Bcl-2途径的交互作用。本研究结合microRNA替代治疗和溶瘤病毒治疗，在治疗MYC异常表达的DLBCL研究领域中有重要意义。