细胞骨架活化NF-κB通路在动态压应力调控髓核细胞Sox9基因和II型胶原体外表达中的作用

椎间盘退变导致一系列严重的脊柱退变性疾病。目前主要治疗方法是手术，并发症多且无法根治。对该疾病的生物学治疗是研究的热点。压应力是导致间盘退变的独立致病因素，其作用的分子生物学机制尚未阐明。椎间盘退变的主要生物学改变是Ⅱ型胶原含量减少。我们发现压应力调控髓核细胞II型胶原表达与NF-κB通路活化状态有关，那么应力如何活化NF-κB通路？这种作用是否与细胞骨架改变相关？应力如何通过NF-κB通路调控髓核细胞Ⅱ型胶原表达？这些科学问题未见文献报道，需进一步研究阐明。我们通过完全仿生的髓核细胞压力模型，拟采用激光共聚焦、免疫电子显微镜、RT-PCR、western-blot、siRNA技术和免疫组化方法，阐明细胞骨架改变与NF-κB活化的关系和作用；压应力条件下NF-κB活化状态对髓核细胞Ⅱ型胶原表达的分子生物学调控机制，为该疾病的发病机理研究、生物治疗及防治策略的制定提供新的理论依据和实验基础。

本课题通过3年的连续研究按照计划完成全部研究内容，并取得了多项具有意义的研究成果。本课题通过对导致椎间盘退变的应力因素的动态观察研究，通过完整的分子生物学调控通路研究宏观致病因素动态变化与微观病理学改变的相互关系。在报道了人体髓核细胞体外动态压应力培养模型的基础上，利用课题组自行设计的专用仪器装置（已获得国家专利，专利号： ZL200820030390.7）完成了人体髓核细胞体外压应力刺激模型的建模工作，摸索并验证了人体髓核细胞体外动态压应力培养模型的最佳力学参数。阐明细胞骨架改变与NF-κB活化的关系和作用；压应力条件下NF-κB活化状态对髓核细胞Ⅱ型胶原表达的分子生物学调控机制，为该疾病的发病机理研究、生物治疗及防治策略的制定提供新的理论依据和实验基础。本课题建立了人体髓核细胞体外动态压应力培养模型。比较和分析动态压应力环境对体外培养椎间盘细胞生长动力学的影响，了解不同强度动态压应力对髓核细胞凋亡的作用，对不同力学环境对髓核细胞体外培养的作用进行了初步评价。结果提示人体髓核细胞体外培养动态压应力加力强度与生长动力学指标呈非线性的相关。2.5Mpa组与各实验组在细胞生长动力学指标的比较中具有显著的统计学差异。本课题对动态压应力环境下体外培养人体髓核细胞微管结构改变对NF-κB通路的活化作用。实验发现动态压应力对体外培养的髓核细胞的微管结构具有显著的活化作用但呈非线性对应关系，2.5Mpa 1Hz的动态压应力对体外培养的人体髓核细胞微管结构具有最佳活化效果。不同强度的动态压应力对人体髓核细胞微管结构的活化状态与NF-κB基因和蛋白的表达量呈正相关关系。阻断微管结构后， NF-κB基因和蛋白的表达量均低于对照组和各实验组。实验研究了体外培养人髓核细胞在动态压应力作用下NF-κB活化对Sox9基因和II型胶原基因表达的调控作用。通过采取RNA干扰技术，对体外培养的髓核细胞的NF-κB基因的有效作用靶点进行了筛选和验证，构建pFU-GW-RNAi对NF-κB基因进行了抑制，同时通过RT-PCR和western免疫印迹等实验方法对下游的Sox9基因和II型胶原基因的表达进行了研究。实验结果提示人体髓核细胞的NF-κB基因存在多可被敲减的基因作用靶点。体外培养的人体髓核细胞在动态压应力作用下，NF-κB通道的活化对Sox9基因和II型胶原基因具有正向相关调控作用。