结肠癌MT1F基因表达缺失的功能作用及其分子机制研究

课题组前期研究发现，结肠正常上皮-腺瘤-腺癌病变过程中，MT1F基因表达依次下调，杂合缺失不能完全解释其失调原因；MT1F能抑制肠癌RKO细胞增殖，但该功能需进一步验证，分子作用机制尚待探讨。MT1F是MT1家族中结构最保守的基因。MT1能直接结合及抑制NFκB激活，抑制肿瘤生长与转移，并受PI3K/Akt调控。由此推测，MT1F通过抑制NFκB发挥抑癌功能，当MT1F表达缺失，促进NFκB活化及结肠癌发生，该异常过程由PI3K/Akt调控，分析结肠癌可能存在PI3K/Akt-MT1F-NFκB信号途径。为证实以上假设，本项目采用基因转染调节结肠癌细胞MT1F水平，体外体内实验观察其功能；利用双荧光素酶报告基因等技术，探讨MT1F对NFκB活性和下游靶基因的影响，阐明其分子机制；反向阻断PI3K/Akt，检测MT1F表达，发现新的信号分子，为干预有效的信号环节或研发新型抗肿瘤药物奠定基础。

本课题前期综合采用LCM和基因芯片，以及LongSAGE对散发性结肠癌进行转录组学研究，并借助生物信息学方法选定位于染色体16q13.1的MT1F为待研结肠癌相关基因；首先我们扩大样本采用Real-time PCR检测发现82.5%结肠癌组织中MT1F mRNA表达水平明显低于对应正常组织。免疫组化结果显示在MT1F mRNA表达下调病例中，结肠癌组织MT蛋白表达低于对应正常组织。然后构建MT1F质粒载体，运用脂质体转染的方法在结肠癌RKO细胞中进行MT1F过表达转染,RKO-GFP-MT1F为实验组，RKO-GFP为NC组，并用G418筛选稳转细胞株。体外功能结果显示，结肠癌RKO细胞外源性过表达MT1F后，细胞增殖速率明显减缓；平板克隆和软琼脂克隆形成实验表明转染MT1F后的RKO细胞克隆形成数量均明显少于亲本细胞及空载体细胞；Transwell实验表明外源性MT1F过表达能使RKO细胞体外迁移和侵袭的能力明显降低；流式细胞技术检测结果发现外源性MT1F过表达能促进结肠癌RKO细胞凋亡，但对细胞周期无明显影响，结合DNA Ladder实验证实MT1F抑制结肠癌细胞生长的功能是通过诱导细胞凋亡实现的。进一步体内裸鼠移植瘤模型结果显示MT1F稳转RKO细胞形成的肿瘤体积和重量均小于对照组，MT1F能抑制结肠癌RKO细胞的体内肿瘤生成。机制研究，我们首先运用MSP方法检测结肠癌组织样本，但未发现结肠癌组织存在MT1F过度甲基化现象；其次，我们将RKO-GFP-MT1F，RKO-GFP以及RKO亲本细胞进行核浆分离后，运用western blot方法检测P65和IκBα蛋白表达情况，未发现MT1F基因可以在结肠癌RKO细胞中调控NF-κB 。最后我们应用PI3K抑制剂Wortmannin以及Akt抑制剂LY294002显性负性技术分别处理RKO-GFP-MT1F和RKO-GFP细胞，运用western blot技术检测P65和IκBα蛋白表达情况，结果显示PI3K/AKt对MT1F和NF-κB 均无影响。