与中国甜柿单宁凝固有关的两个功能基因及其育种应用研究

本项目以包括'罗田甜柿'在内的中国原产完全甜柿（中国甜柿）为试材，以非完全甜柿和日本原产完全甜柿（日本甜柿）为对照，首先采用同源克隆法获得乙醛代谢的两个关键酶（丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶）基因或基因家族cDNA片段，通过生物信息学分析推测其功能，并通过5'Tail-PCR和3'RACE技术获得相应cDNA全长；进而通过分析其在不同脱涩类型（中国甜柿、日本甜柿和非完全甜柿）、不同发育阶段（花后第6周、第11周和第18周）、不同部位（萼片、果皮、果肉、果心和种子），以及乙醇处理后的表达模式差异并结合单宁成分和含量分析，筛选与中国甜柿单宁凝固直接有关的目标cDNA；然后通过构建正义和反义表达载体转化柿愈伤组织进一步确认其功能；最后基于上述结果和技术初步建立起完全甜柿遗传改良的分子育种技术体系。从而为进一步阐明中国甜柿自然脱涩特点，以及选育具自主知识产权的完全甜柿新品种奠定基因资源和技术基础。

中国甜柿自然脱涩机理明显有别于仅依靠“稀释效应”的日本甜柿，除“稀释效应”外可能还涉及可溶性单宁向不溶性单宁转化的“凝固效应”。本研究以中国甜柿‘罗田甜柿’为试材，通过研究其果实发育期单宁细胞大小和可溶性及不溶性单宁含量的动态变化，发现在果实发育过程中可能与自然脱涩有关的可溶性单宁向不溶性单宁的转化现象；利用同源克隆从中国甜柿中分离了参与乙醛代谢的DkADH和DkPDC基因；进而分析其在不同脱涩类型、不同发育阶段、不同部位表达模式，并结合单宁含量分析及活体叶片瞬时遗传转化验证其功能，明确其为与中国甜柿单宁凝固有关的关键基因。同时，基于农杆菌介导的注射渗透法，首次建立了柿活体叶片瞬时超表达和瞬时干涉技术体系；应用454 GS FLX Titanium测序技术，以乙醇脱涩后（Tr）及对照（Co）‘罗田甜柿’果实的转录组分析，发现3639条差异unigene基因中含有单宁凝固基因ADH和PDC；利用与中国甜柿自然脱涩性状连锁的分子标记（RO2）鉴定出6份完全雄性和4份完全甜柿单株含有该标记，将该标记用于两个杂交群体中完全甜柿个体的早期选择，发现其为1:1比例分离，进一步说明控制中国甜柿自然脱涩性状的可能为单个显性基因。此外，我们开发了柿属植物专用EST-SSR和TRAP分子标记，并在柿属植物种质鉴定和亲缘关系分析中初步应用。该项目已发表学术论文6篇，培养博士3名、硕士2名，组织或参加学术会议7次。