与中国甜柿自然脱涩有关的Myb类转录因子基因克隆及其功能验证

中国甜柿自然脱涩受显性基因AST/ast控制，因而在遗传改良上较日本甜柿更具利用价值，但其脱涩机理尚不完全清楚。本项目以包括'罗田甜柿'在内的中国甜柿为试材，以非完全甜柿和日本甜柿为对照，首先采用同源克隆法获得Myb类转录因子基因cDNA片段，通过生物信息学分析推测其功能，通过5'Tail-PCR和3'RACE技术获得cDNA全长；进而通过分析其在不同脱涩类型（中国甜柿、日本甜柿和非完全甜柿）、不同发育阶段（花后第3、第9和第15周）、不同部位（萼片、果皮、果肉、果心和种子）表达差异并结合单宁含量分析，筛选与中国甜柿自然脱涩有关的目标cDNA；然后通过构建正义和反义表达载体转化柿愈伤组织进一步确认其功能；最后通过与DHD/SDH、F3'5'H、ANR、SCPL、PDC和ADH等结构基因表达情况的一致性分析，初步推测其调控靶基因。从而为中国甜柿自然脱涩机理以及分子技术育种研究提供科学依据。

柿果果肉组织存在特化的单宁细胞，其液胞中大量累积的柿单宁（原花青素）是导致涩感的主要原因。与日本甜柿在果实发育的早期即可自然脱涩的特点不同，中国甜柿在果实成熟之前才能自然脱涩，但其脱涩机理迄今尚不明确。本研究以中国甜柿‘罗田甜柿’和‘小果甜柿’为试材，通过研究其果实发育期单宁细胞大小和可溶性及不溶性单宁含量的动态变化，发现其存在可溶性单宁向不溶性单宁的转化现象；利用同源克隆获得柿单宁代谢途径中Myb转录因子基因（DkPA1），发现其编码蛋白具MYB转录因子的典型结构域，属于R2R3类MYB转录因子；通过邻接法的进化分析发现其与已报道的其他物种中参与单宁调控MYB转录因子具有极高的序列相似性；DkPA1在‘罗田甜柿’与‘磨盘柿’中的表达模式与其可溶性单宁的累积模式一致，与结构基因DkDHD、DkSCPL、DkF3’H、DkF3’5’H、DkANR的表达模式也一致；DkPA1转录因子可能特异结合DkLAR、DkLAC1、DkMATE1启动子序列中MYBCORE顺式元件，进而调控这些基因的表达；应用454 GS FLX Titanium测序技术，以乙醇脱涩后（Tr）及对照（Co）‘罗田甜柿’果实进行转录组测序，3639条差异unigene基因中含有Myb类转录因子基因；通过同源克隆获得转录因子基因DkMYC1、DkWD40和结构基因DkLAC、DkGST、DkMATE1，对其进行时空表达及其与中国甜柿自然脱涩的关系分析。此外，利用与中国甜柿自然脱涩性状连锁的分子标记（RO2）鉴定出6份完全雄性和4份甜柿变异单株含有该标记，这些种质可能成为中国甜柿育种新的双亲亲本；将该标记用于两个杂交群体中完全甜柿个体的早期选择，发现其呈现1:1分离，说明控制中国甜柿自然脱涩性状的可能为单显性基因位点；开发了针对柿属植物专属EST-SSR和TRAP分子标记，并在柿属植物种质鉴定和亲缘关系分析中初步应用。在国外专业期刊发表学术论文9篇。培养博士4名，硕士1名，组织召开学术会议4次。