Dll4/Notch信号通路调节VEGF促进诱导膜的形成和引导骨再生中血管生成的机制研究

The repair of bone defects is a tough problem in the orthopaedic research. The technique of bone cement inducing membrane can effectively promote bone regeneration. However, it exists problem of microvessel reduction (Liu, et al, ORST, 2013)and its mechanism is unclear. In our preliminary research, we found that VEGF could promote angiogenesis and Dll4/Notch signaling was expressed in induced membrane formation. This project is a in-depth study of the regulating mechanism of Dll4/Notch signaling on VEGF promoting angiogenesis in induced membrane formation and guided bone regeneration. By using the femoral bone defect of rat model, membrane is induced and microvascular endothelial cells are obtained from the induced membrane. Noggin and DAPT are used for antagonistic action of BMP and Dll4/notch signaling, respectively. We evaluate 1) the negative or positive regulating effect of Dll4/Notch signaling on VEGF promoting angiogenesis in induced membrane formation and guided bone regeneration; 2) the BMP actived positive and negative transformation of Dll4/Notch signaling on angiogenesis. Findings of this study will be beneficial to precise control of histological characteristics of induced membrane, rapid and homogeneous repair of bone defect, and will lay an foundation for the development of induced membrane technology repairing bone defect.

骨缺损的修复是骨科的一个难题。骨水泥诱导膜技术能有效促进骨的再生，但存在诱导膜中微血管减少的问题(Liu, et al, ORST, 2013)，其机制尚不明确。我们的前期工作发现VEGF能促进诱导膜中微血管的生成，诱导膜形成中有Dll4/Notch信号的表达。本项目拟进一步研究 Dll4/Notch信号通路调节VEGF促进诱导膜形成和引导骨再生中血管生成的机制。采用大鼠的股骨骨缺损制备诱导膜模型，并分离培养诱导膜中的微血管内皮细胞，使用Noggin和DAPT分别拮抗BMP和Dll4/notch信号通路，评估1)Dll4/Notch信号通路对VEGF在诱导膜形成和引导骨再生中负、正性调控微血管生成的作用;2) BMP对Dll4/Notch信号通路正/负性调控微血管生成的转化作用。本研究的发现有利于诱导膜组织学特性的精确控制和骨缺损的快速均一修复，为诱导膜技术修复骨缺损的发展奠定基础。

项目背景：Masquelet的诱导膜技术由于良好的生物学功能在节段骨缺损中有着广泛的应用。但诱导膜对骨修复的分子生物学机制，诱导膜的血管退变机制，以及改善诱导膜的的血管形成是否促进骨修复的研究仍缺乏。.研究内容：1.采用诱导膜在体外干预大鼠的间充质干细胞，促使成骨分化，并以BMP-2干预作为阳性对照。2.评估Dll4/Notch1信号通路在诱导膜中的表达，采用DAPT干预诱导膜，评估其对诱导膜促进骨修复的影响。.结果：1. 我们的研究发现诱导膜促进了 BMSCs 的成骨分化，表现为促进 Runx2, Collagen I, OCN和ALP的mRNA和蛋白表达增高，相比阴性对照组明显，但不及BMP-2组。且通过应用Smad1/5/8的抑制剂 LDN-193189 和 ERK1/2的抑制剂 U0126 加入诱导膜一起干预，发现诱导膜引起的Runx2, Col I和OCN 表达增加受到了抑制。验证了诱导膜是通过激活Smad1/5/8 和 MAPK 信号通路促进 BMSCs 的成骨分化。2.我们发现Dll4/Notch1信号通路主要在诱导膜形成的后期激活，在皮下部位更明显。应用DAPT去抑制Notch1的激活，发现VEGFR2 和CD31的表达增加。DAPT修饰的诱导膜能促进自体骨移植后的骨修复。在体外Notch1 基因沉默促进了血管内皮祖细胞的功能改善，DAPT处理的诱导膜相比对照组更加促进血管内皮祖细胞的血管新生。.结论：我们的研究提示诱导膜通过 Smad1/5/8 和MAPK信号通路促进大鼠BMSCs的成骨分化。DLL4/Notch1 信号通路和诱导膜的微血管密度呈负性相关，药物抑制Notch1在体外和体内均减缓了诱导膜血管形成的退化，促进骨缺损部位的骨形成和皮下部位的移植骨吸收。此研究对临床诱导膜技术修复骨缺损的改进提供了实验基础。