微生物运动高通量表征方法的建立和应用

Prevention of biofilm formation is an important, health-related and multidisciplinary research direction. Twitching motility plays essential and distinctive roles through different stages of biofilm formation, for example, at the early stage, twitching motility facilitates bacteria to adapt to surfaces. And at the later stage, twitching motility is required for mature biofilms to form mushroom-like structures. Therefore, twitching motility has received broadly attentions in recent years. However, the in situ method that can be applied to quantitatively characterize twitching motility during biofilm formation is quite limited. By using a combination of high-throughput data acquisition, automatic image processing, database establishment and big data visualization, here, we propose a novel method that can quantitatively characterize twitching motility in high throughput and in single-cell scale manners. Afterwards, we will systematically investigate how twitching motility responds to stimulation of various external signaling molecules or switches of specific internal signaling transduction pathways during the Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. These results will help us to uncover the underlying mechanism by which bacteria deploy their motilities. Finally, we will investigate how these mechanisms affect biofilm formation using modeling and simulations.

细菌生物被膜的防治是关乎人类健康的重要课题，阐明生物被膜形成的机制对其防治具有重大意义。其中，蹭行运动在生物被膜形成过程中对初期细菌适应表面环境以及对后续生物被膜三维结构的形成起决定性作用。因此，蹭行运动的原位表征、量化是生物被膜形成机制研究中的重要科学问题之一，但目前仍缺少成熟完整的方法。针对以上问题，通过集成高通量数据采集、自动化图像处理、数据库建立以及图形化输出等技术，我们拟建立一整套快速、基于单细菌层面的方法实现对蹭行运动的高通量表征。利用所建立的方法，我们将在铜绿假单胞菌生物被膜形成过程中系统地研究、量化多种外源信号分子、胞内信号传导通路对蹭行运动的影响，从而进一步阐明蹭行运动的调节机制。再根据所发现的调节机制建立数学模型，并通过计算模拟的方法揭示蹭型运动在生物被膜形成各个阶段发挥的作用，从而最终为细菌生物被膜的防治奠定理论基础。

铜绿假单胞菌在固体表面上的蹭行运动介导了细菌的表型转变，蹭行运动对其在环境中形成生物被膜和感染宿主有重要的作用。在本项目中，我们主要围绕着对蹭行运动的定量表征和用合成生物学的思路人为控制细菌蹭行运动这两个主题逐步展开。相比于传统的通过在凝胶板底穿刺后观察菌斑扩张大小来评估蹭行运动能力，用亮场显微镜成像结合图像处理的方法可以在单细菌水平上对蹭行运动做定量分析，并且为蹭行运动的量化增加了维度（细菌运动速度，转动速度，翘起角度，不同运动型的区分和所占比例等）。本项目首先完成了蹭行运动分析方法的标准化和自动化，然后基于光遗传学的手段，我们把光响应的cAMP合成酶基因导入到铜绿假单胞菌的基因组上，使细菌胞内的cAMP合成对光照敏感，从而实现了用光照来控制细菌的蹭行运动活性。光照下细菌胞内cAMP浓度增加6.6倍，蹭行运动平均速率增加8倍。定量分析的结果显示，光照前后细菌蹭行运动的行走子表现型增加而原地挣扎子表现型减少，而且各个子表现型的平均运动速度和转动角速度都明显增加。我们进一步利用光照的方式实现了对菌群扩张方向以及细菌对宿主感染力的控制，细菌对宿主小鼠的毒力在光照下提高了14倍。以上结果充分说明用光遗传学方法控制蹭行运动的可行性，并为未来细菌-宿主相互作用的研究提供了思路。另一方面，我们在基础研究层面上探索了铜绿假单胞菌内部另一种Tad菌毛的环境响应信号通路和可能的功能。我们筛选出了诱发Tad菌毛表达的多个环境因素，包括碳源、氮源、磷源等的饥饿张力以及其他导致细菌应激反应的环境。我们进而挖掘出一条RelA-ppGpp-RpoS-PprB-flp/cupE/bap信号传递路线，并发现PprB转录因子本身的磷酸化并不影响其对下游基因的转录调节活性，颠覆了以往的认知。最后，我们通过对细菌聚集形态及其对表面粘附力的定量表征发现Bap粘附蛋白和Tad菌毛分别帮助和抑制细菌聚集，而Bap粘附蛋白和CupE菌毛共同促进了细菌对表面的粘附作用。以上发现为探究Tad菌毛及PprB下游系统的生理功能指明了方向。