直接检测血液中疟原虫RNA：高灵敏度、高通量分子诊断疟疾方法的建立和应用研究

The decline in malaria transmission in China makes it possible to consider elimination of the disease. As we approach elimination, malaria diagnosis needs to change from diagnosing ill patients to actively detecting infections in all carriers including asymptomatic and low-parasite load patients. However, none of the current diagnostic methods has both the throughput and the sensitivity required, resulting in recent increase in imported transmission and antimalarial overuse. We propose two novel assays to detect genus Plasmodium 18S rRNA directly from the whole blood of malaria patients without RNA isolation. The assays use 20μl of each blood sample in 96-well plate format with a two-day ELISA-like workflow, with equal or better sensitivity and specificity than quantitative PCR. We will evaluate these assays in endemic areas at Yunnan province, in field applications such as large scale active community screening and quality assurance of field microscopy and PCR diagnosis.

随着疟疾发病率的降低，我国的疟疾防治从控制策略转为消除策略，以及消除之后对周边国家输入性疟疾引起的继发性传播的监测。为了达到消除疟疾的目的，疟疾诊断应当从被动地针对发热病人，改为主动地筛查出疟疾流行区的所有的疟原虫携带者，包括疟疾现症病例和无症状带虫者。这对疟疾诊断方法提出了很高要求：需要较高的灵敏度以检测出低虫血率感染者或无症状带虫者，以及高通量检测样品能力，以实现对疟疾的主动筛查。现有诊断方法则无法满足要求，这一现状造成我国许多地区当地感染的原发性疟疾持续存在和抗疟药滥用。本项目将研究出两种新型RNA检测方法，可以高通量地从血中直接检测出疟原虫rRNA，不需要提取RNA或逆转录，灵敏度不低于定量PCR法。我们将把这些方法应用于云南省边境疫区对疟疾的主动筛查，以及作为质量监控的手段抽查云南疟疾镜检水平及PCR检测水平。

当前包括中国在内的多数发达、发展中国家仍然面临着疟疾的威胁。为了实现疟疾的根治，云南省每年约需要主动筛查35万份样品。但随着疟原虫感染率的逐渐下降，越来越多的感染者呈现无症状的状态，多数诊断方法无法测出这部分人群，及时发现和治疗这些可成为新感染源的无症状携带者是根治疟疾行动成功的关键。我们已按计划研究出两种世界领先的新型RNA检测方法，均可以在96孔板内直接检测全血或干血片中疟原虫rRNA，无需核酸提纯或逆转录。灵敏度均高于目前标准荧光定量PCR法，为目前最灵敏的分子检测方法之一。检测通量远高于现有任何方法。出于简便性和临床适用性考虑，选择第二种方法（CLIP-PCR）作为推广方法，已在我国云南省疟疾监测实践中推广应用多年，包括将该技术带到边境乡镇现场从事检测，普通大专毕业生仅需要几天的培训即可掌握。CLIP-PCR能方便高效准确地诊断出疟疾感染者（包括被标准方法漏检的无症状感染者）。该方法利用类似ELISA的操作流程，一个技术员仅需要4～6小时即可完成上千例样品从血样到信号的全部工作。该技术的另一个主要优势就是适用于滤纸干血片的混样检测。在3358例临床样品的主动筛查中，该方法仅需要不到500个检测反应即可完成筛查，平均成本不足3元人民币／例样品。这大大解决了疟疾大规模筛查中所面临的人力和资金短缺问题。使得新技术的临床应用更容易实现。