拟南芥通用转录因子TAF6调控RNA介导的DNA甲基化的分子机制研究

DNA methylation is a highly conserved epigenetic modification that is associated with gene silencing and plays critical roles in imprinting, transposon repression, immunity and diverse developmental processes in eukaryotic organisms. Although roles of several important factors that required for RNA-directed DNA methylation（RdDM）are known, relatively little is understood about how PolV targets to transposable elements in the genome. To better address this question, complementary approaches involving forward genetic study and molecular study were undertaken, leading to the discovery of TAF6, a general transcription factor, that promotes the LUCH report gene transcriptional silencing. Our current molecular analysis revealed a novel function of TAF6, as mediating RdDM. In this proposed study, genetics, molecular biology, genomics and cell biology will be employed to investigate the underlying molecular mechanisms in mediating RdDM by affecting the recruitment of PolV to target regions. We will also try to dissect the role of TAF6-TAF9 in mediating RdDM. This study will elucidate the molecular mechanism of PolV precisely recognize and bind to target loci，and expand the current view on the function of general transcription factors in RdDM and transcriptional gene silecing.

DNA甲基化是与基因转录沉默相关的高度保守的表观遗传修饰，在基因印迹，转座子沉默，生物免疫和生长发育的各个过程中起着非常重要的作用。尽管当前的研究已经解析了大量RdDM通路蛋白的主要功能，然而PolV结合基因组启动转录的具体分子机制还知之甚少，为了解析这一重要的科学问题，本项目通过正向遗传学发现通用转录因子TAF6促进LUCH报告基因的转录沉默。初步研究表明TAF6直接调控RdDM通路，本研究将围绕揭示转录因子TAF6的新功能，综合采用遗传学，分子生物学，基因组学和细胞生物学等多种研究手段，解析TAF6通过影响PolV对基因组的识别和结合，直接调控RdDM通路的具体分子机制，并尝试探求TAF6－TAF9二聚体在这一调控过程中的作用，以期阐明PolV蛋白复合体如何精准识别结合基因组的分子机制，为高等植物DNA甲基化建立的调控机理提供全新的认识。

DNA甲基化是植物生长发育过程中重要的表观调控机制，在转座子转录沉默和基因精准调控方面起着重要作用。拟南芥DNA甲基化的建立依赖PolIV转录的siRNA和PolV转录的支架转录本。为揭示DNA甲基化建立的分子机理，本项目利用全新的甲基化报告基因体系LUCH，筛选获得高萤光突变体，图位克隆及遗传互补实验表明通用转录因子TATA结合蛋白6（TAF6）突变抑制了LUCH的转录沉默。除报告基因外，研究还发现一些内源RdDM位点的DNA甲基化和转录沉默也需要TAF6。全基因组甲基化分析结果表明突变体taf6主要使267个位点CHH甲基化显著下降，其中95%与PolV和PolIV调控位点重叠，全基因组smallRNA分析结果表明taf6不影响siRNA的丰度和分布，而影响PolV依赖的支架转录本的合成，结合RNA-SEQ分析结果，支持TAF6直接参与RdDM通路。染色质免疫共沉淀（ChIP-qPCR）和RNA免疫共沉淀（RIP-qPCR）研究发现突变体taf6中PolV与基因组靶位点和支架转录本的结合显著降低，免疫荧光还发现TAF6与NRPE1部分共定位。以上结果表明TAF6具有使PolV蛋白复合体与基因组靶位点和支架转录本精准结合，促进甲基化和基因转录沉默的新功能。此外，酵母双杂交和Co-IP实验结果表明TAF6与TAF9互作，TAF9突变体萤光表型与taf6一致，说明TAF6与TAF9形成二聚体，可能在这一调控过程中的发挥重要作用。本研究为高等植物DNA甲基化建立的调控机理提供了全新的认识。