镉胁迫下DNA MMR系统调控拟南芥RNA m6A甲基化机制

Both in Europe and, more recently in China, Cadmium (Cd) has been remaining the main pollutant in water and soil because it is extensively used in the chemical industry, agriculture and city development. Therefore, biomarkers for detecting bioavailable Cd are important for assessing the level of contamination and the success of efforts in land remediation. Plants can provide excellent biomarkers as they are sedentary and can be monitored in situ. In this project, UVB will be used as positive control to comparatively study variation trend of RNA m6A methylation, expression of RNA methylation genes, and expression of DNA damage response (DDR) key genes/proteins in Arabidopsis induced by Cd stress. Effects of gene knock-out mutants (MSH2-KO, MSH6-KO, MLH1-KO) and RNA interference cell lines (MLH1-KO/MTAsiRNA, MSH2-KO/MTAsiRNA, MSH6-KO/MTAsiRNA) on above processes will be explored to elucidate response mechanism of RNA m6A methylation on Cd stress. Furthermore, whether DNA mismatch repair (MMR) system regulates RNA m6A methylation dependent DNA repair is verified by identifying the correlations between MMR genes molecular behavior and RNA m6A methylation. Finally, dose response relationships will be analyzed by combining Cd content to confirm whether Arabidopsis RNA m6A methylation aberration could be sensitive and/or specific biomarkers of Cd exposure. The above results could help to unravel Cd toxicological mechanism and provide new molecular biomarkers for Cd pollution.

本项目以UVB作为阳性对照，利用基因敲除突变和RNA干扰等技术，研究镉胁迫下野生型拟南芥RNA m6A（6-甲基腺嘌呤）甲基化、RNA甲基化基因表达与DNA损伤反应关键基因/蛋白表达的变化趋势；探讨镉胁迫下拟南芥基因敲除突变（MSH2-KO、MSH6-KO、MLH1-KO、MLH1-KO/MTAsiRNA、MSH2-KO/MTAsiRNA、MSH6-KO/MTAsiRNA）对上述过程的影响；阐明拟南芥RNA m6A甲基化对镉胁迫的响应机制；明确拟南芥DNA错配修复（Mismatch repair, MMR）基因分子行为与RNA m6A甲基化的关系，证明DNA MMR系统参与调控依赖RNA m6A甲基化的DNA损伤修复；结合镉含量分析RNA m6A甲基化改变与镉暴露之间的剂量-效应关系，以明确RNA m6A甲基化改变可否作为镉暴露的生物标志物，丰富对镉毒理机制的认识并提供新的镉污染标志物。

Cd毒理效应的植物基因诊断研究是国际学术界的研究焦点之一，但有关植物DNA MMR在生态毒理学的研究基础薄弱，而有关植物RNA甲基化的Cd毒理研究更是鲜有报道。本项目研究结果表明，Cd胁迫下植物细胞内会出现不同形式的DNA损伤，DNA损伤会迅速诱导DNA损伤反应（DDR）信号，如ATM、ATR及其下游的信号通路包括细胞周期阻滞、细胞内复制、细胞凋亡以及不同形式的DNA 修复途径（如同源重组修复HR、DNA错配修复MMR）。植物细胞 DNA MMR 系统中的异源二聚体 MutSα（MSH2/MSH6）、MutSβ（MSH2/ MSH3）、MutSg（MSH2/MSH7）、MutLα（MLH1/PMS1）与有关酶如增殖细胞核抗原（PCNA）、DNA复制因子C（RFC）、DNA核酸外切酶1（EXO1）、单链结合蛋白（RPA）等相互作用，启动 DNA MMR反应，从而在感知Cd诱导的DNA损伤、修复DNA损伤、激活细胞周期检验点、确保基因组的稳定性等方面发挥关键作用。然而，MutS缺失的植物细胞会绕过DNA MMR系统，从而严重影响植物基因组的稳定性。在Cd（0.5～4.0 mg·L-1）诱导的DDR中，野生型拟南芥表现为随Cd浓度增大而RNA m6A甲基化降低，且趋势变化稳定。该结果说明在MMR功能正常时，随着Cd浓度增加DNA损伤增加，但细胞周期阻滞与有效的DNA修复降低了RNA m6A甲基化。当MMR功能缺失后，DNA损伤感知与修复功能下降，导致拟南芥RNA m6A甲基化水平发生显著变化。MSH6基因功能缺失，导致错配感知与招募修复蛋白功能降低，DNA损伤增加，使RNA m6A甲基化水平整体提升。MLH1基因功能缺失，阻滞了DNA错配修复和ATM依赖的DNA双链修复及信号转导，不仅扭转了RNA m6A甲基化趋势，还参与无胁迫下的RNA m6A甲基化。MSH2基因功能缺失，影响DNA碱基损伤的感知与信号转导，使RNA m6A甲基化水平提升，尤其是低浓度胁迫下。另外，在大豆的Cd胁迫响应研究中，发现MMR基因功能决定了大豆品种间的Cd耐受性。在番茄嫁接后的Cd胁迫响应研究中，发现miR166a 和miR395b通过调控硫酸盐跨膜转运影响植物Cd积累。以上结果为植物Cd胁迫的毒理机制研究提供了重要的科学依据与研究基础，也为植物耐Cd与Cd低积累品种选育提供理论依据。