基于TNF-α为靶点的海蛇蛇毒抗炎活性成分及其作用机制的研究

Sea snakes used for rheumatoid arthritis and other autoimmune diseases in Chinese medicine, but in the anti-inflammatory and immune pharmacological research field, the anti-inflammatory activity of composition and mechanism was unknown. In the previous study, a new toxin peptide Hydrostatin-1 was found by TNF-α biopanning Hydrophis Cyanocinctus T7 phage display library, with TNF-α combination of blocking its biology activity. This project plans to construct Hydrophis Cyanocinctus T7 phage display library, biopanning based on TNF-α as a target for anti-inflammatory activity component, combined with RACE method to acquire the active components of the full-length gene, structure and function prediction; the active ingredient was expressed and purified by molecular cloning technology; confirmation of active component and TNF-α interactions; ELISA and cytological experiments confirmed active components on TNF-α pro-inflammatory activity inhibition; finally, active ingredient in vivo anti-inflammatory and immune regulation effect was evaluated in collegen-induces arthritis mouse model, so as to systematically study the anti-inflammatory activity of components and mechanism. This project will be expected to be found with a class TNF-α as a target, with independent intellectual property rights of the new TNF-α small molecule antagonist, and for further structural optimization, molecular design.

中医以海蛇入药用于风湿性关节炎等自身免疫性疾病，但在其抗炎和免疫药理研究领域，抗炎活性成分和作用机理未明。我们在前期研究中通过TNF-α淘选青环海蛇噬菌体展示文库发现一个新的毒素小肽Hydrostatin-1，可以与TNF-α结合并阻断其生物学活性。本项目拟构建青环海蛇蛇毒毒腺噬菌体展示文库，淘选基于TNF-α为靶点的抗炎活性成分，并结合RACE 等方法获取活性成分的全长基因，进行结构与功能预测；通过分子克隆技术表达、纯化该活性成分；确证活性成分与TNF-α的相互作用；ELISA 和细胞学实验确证活性成分对TNF-α促炎活性的抑制作用；最终在关节炎动物模型上评价活性成分的体内抗炎和免疫调控效应，从而较系统地研究其抗炎活性成分及作用机制。本项目的完成将有望发现一类以TNF-α为作用靶点，具有自主知识产权的新型TNF-α小分子拮抗剂抗炎候选药物，并为进一步的结构优化、分子设计奠定基础。

中医以海蛇入药用于风湿性关节炎等自身免疫性疾病，但在其抗炎和免疫药理研究领域，抗炎活性成分和作用机理未明。本课题较系统地研究了青环海蛇蛇毒抗炎活性成分及其作用机制：1、构建了青环海蛇蛇毒毒腺噬菌体展示文库，并建立了以TNF-α为靶点的淘选抗炎活性成分的方法，获得了2条新型海蛇蛇毒抗炎活性肽：Hydrostatin-TL1（9AA，ATSKPSLKC-COOH）和Hydrostatin-SN1（22AA ，DEQHLETELHTLTSVLTANGFQ -COOH）；2、Hydrostatin-TL1能够与TNF-α结合，竞争性的抑制TNF-α与TNFR1的结合，能抑制炎症因子的表达、炎症信号通路NF-ĸB及MAPKs的激活，对内毒素（LPS）诱导的小鼠急性休克模型和葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠急性结肠炎模型具有明显的抗炎活性；2、Hydrostatin-SN1与TNFR1的结合能力高于其与TNFR2的结合能力，能竞争性的抑制TNF-α与其两种受体间的相互作用，通过抑制炎症信号通路NF-ĸB及MAPKs的激活从而有效抑制TNF-α活性的生物学功能；3、以Hydrostatin-SN1为先导肽进行了进一步的结构研究：通过同源建模、生物信息学等，分析对TNF-α介导的细胞毒的影响，对炎症因子表达、NF-κB及MAPKs信号通路的影响；同时利用LPS诱导的小鼠急性休克模型进行筛选，获得Hydrostatin-SN10（10AA，DEQHLETELH）。Biacore、微量热泳动技术（MST）结果表明，Hydrostatin-SN10能与TNFR1直接相互作用，与TNFR1的结合能力约为2.8μM；且只与TNFR1结合，而不与TNFR2结合，具有选择性，能竞争性抑制TNFR1-TNF-α的相互作用；Hydrostatin-SN10对类风湿性关节炎动物模型（CIA小鼠）和炎症性肠病（IBD）动物模型都具有明显的抗炎活性。总之，本课题建立了以TNF-α为靶点淘选海蛇蛇毒抗炎活性成分的方法，获得了2条抗炎活性肽，进一步的结构研究获得了选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10，研发其成为新型选择性TNF-α受体抑制剂多肽药物正在进行中。本课题也为从类似复杂文库中靶向分离其他生物活性物质提供了一个新思路，并对中药复方中蛋白多肽类活性成分的分离和鉴定起到一定的借鉴意义。