旋覆化倍半萜内酯类成分与TNF-α的相互作用及其抗炎活性研究

近年来临床上以抗TNF-α抗体等生化药物治疗类风湿性关节炎等自身免疫性疾病取得重大进展，但对直接作用于TNF-α的小分子拮抗剂的研究报道极少。我们在前期研究中发现一种从具有抗炎作用的中药- - 旋覆化中分离的倍半萜内酯类成分SC-8能直接与TNF-α结合并阻断其生物活性。本项目拟对从同一中药部位分离的SC-8结构类似物展开系列研究，首先以BIACORE生物分子相互作用分析手段比较该类化合物与TNF-α的直接结合能力，定量测定不同化合物与TNF-α结合的平衡常数并分析其介导结合的核心结构；进而采用ELISA和细胞学实验确证该类化合物对TNF-α与其受体结合的影响以及对TNF-α促炎活性的抑制作用；最终在关节炎动物模型上评价该类化合物的体内抗炎和免疫调控效应。本项目的完成将有望发现一类以TNF-α为作用靶点的新型抗炎候选药物，为TNF-α小分子拮抗剂的进一步结构优化、分子设计和新药研发奠定基础。

TNF-α参与多种炎症和自身免疫性疾病的发病和发展。我们在前期研究中从抗炎中药旋覆花中发现了一种倍半萜内酯类成分 Jap A能与TNF-α结合，并抑制TNF-α的活性。本项目拟通过对同一中药部位分离的结构类似物的TNF-α靶向作用的系列研究，发现一类靶向 TNF-α的新型抗炎候选药物。迄今，所有的计划研究内容均已完成，研究成果包括：（1）采用Biacore T200进一步确认了Jap A与TNF-α的直接相互作用，并采用凝胶过滤、非变性凝胶电泳、圆二色谱测定等方法证明Jap A与TNF-α结合后并不促使TNF-α三聚体解聚，而是导致TNF-α三聚体发生了微弱的构象变化，进而抑制TNF-α与其Ⅰ型受体（TNFR1）的结合，而对TNF-α与其Ⅱ型受体（TNFR2）结合的影响则相对较弱提示Jap A可能主要抑制TNF-α的促炎作用，对抗感染免疫应答的影响较小。（2）对40多种旋覆花倍半萜类化合物进行了多层面的筛选和活性比较。首先采用采用TNF-α杀伤L929细胞为筛选模型，发现13种化合物和Jap A相似，单独对L929细胞的增殖无影响，但抑制 TNF-α杀伤L929细胞的活性。进一步筛选能有效抑制TNF-α与其受体结合的化合物，发现10种化合物既能抑制TNF-α杀伤L929细胞的活性，又能抑制TNF-α与其受体的结合，而且进一步发现其中6种化合物与Jap A非常相似，对TNF-α与TNFR1的结合具有选择性的抑制作用。最后采用Biacore进一步确认这些化合物与TNF-α可以直接结合。有意思的是，在上述6种化合物中，有5种是与Jap A结构非常相似的倍半萜二聚体。（3）对该类化合物的体外抗炎活性研究发现Jap A能阻断TNF-α刺激的293细胞内NF-κB信号通路活化， 而对IL-1的刺激作用基本无影响；在TNF-α刺激内皮细胞上，Jap A能阻断NF-κB、JNK、 p38和ERK等多条信号通路的活化，进而抑制TNF-α刺激的ICAM-1、VCAM-1和MCP-1等炎症应答基因表达。采用 TNF-α 联合D氨基半乳糖诱导的小鼠急性肝炎模型和胶原诱导的关节炎模型评价Jap A的体内抗炎效应，发现Jap A对急性肝炎和慢性关节炎症均有显著的防治效应。这些研究为进一步研发小分子TNF-α拮抗剂提供了先导化合物，同时为进一步的结构优化、分子设计和新型抗炎药物的研发奠定了基础。