转录因子Pit-1磷酸化及其调控机制在垂体瘤发生发展中的作用研究

Pituitary adenomas are commonly encountered intracranial neoplasms. Pit-1 plays a key role in the specification, expansion and survival of three specific pituitary cell types (somatotropes, lactotropes and a subset of thyrotropes) during the development of the anterior pituitary. Based on sequence analysis, we identified Ser-126 in Pit-1 as the only consensus phosphorylation site for Cyclin dependent kinase 5 (Cdk5). We detected a physical interaction between Cdk5 and Pit-1 in pituitary adenomas. In the preliminary experiments indicated that inhibition of Cdk5 activity reduced the release of PRL and GH in GH3 cells. Pit-1 pSer-126 expression is significantly increased in human pituitary adenomas as compared to normal pituitary. In the current study, through further investigation the effect of phosphorylation of Pit-1 on Ser-126 on the function of transcription regulation, the formation of transcription complexes and its signal transduction pathway in pituitary adenomas, reveal CDK5-mediated Pit-1 phosphorylation controls prolactin and growth hormone pituitary adenomas progression and Pit-1 pSer-126 serves as a potential prognostic biomarker for molecular diagnosis and therapy of pituitary adenomas.

垂体瘤是一种常见的神经系统肿瘤。垂体特异转录因子-1 (pituitary specific transcription factor，Pit-1)是垂体发育中最重要的组织特异性转录因子之一。前期生物信息学筛查发现Pit-1的126位丝氨酸是细胞周期素依赖激酶5（Cyclin dependent kinase 5，Cdk5）潜在的特异性磷酸化位点，且Cdk5和Pit-1存在相互作用。实验表明垂体瘤组织中Pit-1的Ser126位磷酸化水平明显高于正常垂体，提示Pit-1的126位磷酸化可能具有重要作用。本研究主要探讨Cdk5如何通过磷酸化Pit-1调控基因转录、激素合成等进程，以及Pit-1 126位丝氨酸磷酸化对转录复合物形成，转录活性调节及下游信号转导的影响，并通过组织芯片筛查Pit-1 126位磷酸化水平与垂体瘤激素分泌、耐药与预后的关系，期望为垂体瘤探寻新的分子靶点提供理论依据。

背景与目的：泌乳素型垂体腺瘤（prolactinomas）是临床最常见的功能性垂体腺瘤，它除了分泌过量的激素外，更容易侵袭性生长，侵犯周围组织。垂体特异转录因子Pit-1（POU1F1）是垂体发育中最重要的组织特异性转录因子之一，它隶属于POU转录因子家族，特异性表达于垂体前叶。CDK5 (Cyclin-dependent kinase5) 是一种特殊的细胞周期依赖性蛋白激酶，能够磷酸化多种转录因子，但是CDK5促进Pit-1磷酸化的机制并不清楚。本研究探讨CDK5如何通过磷酸化Pit-1调控基因转录及下游信号转导，以及Pit-1的126位丝氨酸磷酸化（pSer126-Pit-1）对细胞增殖及激素合成的影响。.材料与方法：生物信息学分析Pit-1的126位丝氨酸是CDK5的潜在磷酸化位点。根据该位点合成了能够特异性识别Ser126-Pit-1的磷酸化抗体并使用该抗体通过western blot检测大鼠垂体瘤CH3细胞中Pit-1的磷酸化水平。使用CDK5的化学抑制剂Roscovitine[1, 2]及其小干扰RNA（siRNA）处理GH3细胞后，通过western-blot检测pSer126-Pit-1水平。向GH3细胞转染野生型的Pit-1质粒和突变型的Pit-1质粒（Ser126A-Pit-1），然后通过流式细胞技术检测GH3细胞的凋亡情况，通过克隆形成及CCK8检测GH3的增殖情况，通过ELISA检测GH3细胞分泌泌乳素（PRL）的含量。通过组织芯片的免疫组化染色观察在48例泌乳素腺瘤中pSer126-Pit-1的表达情况。.结果：与对照组相比，在使用Roscovitine抑制或者siRNA敲降CDK5后，GH3细胞中Ser126-Pit-1磷酸化水平明显降低。转染野生型Pit-1的GH3细胞活力明显高于转染突变型的Pit-1的GH3细胞，且前者细胞凋亡明显少于后者。EMSA实验及双荧光素酶基因报告结果显示，与突变型Pit-1细胞组相比，野生型的Pit-1与PRL启动子结合能力明显增强，而且细胞分泌PRL能力也明显高于突变型细胞组。此外，高水平的Ser126-Pit-1的磷酸化与泌乳素垂体瘤患者不良预后相关。.结论：CDK5介导Ser126-Pit-1磷酸化促进泌乳素型垂体腺瘤的增殖及激素分泌并抑制垂体腺瘤细胞凋亡。