基于血清代谢组学的ALT低于2倍正常值慢性乙型肝炎抗病毒标志物筛选及功能学研究

Several guidelines recommend antiviral therapy for hepatitis B patients with an alanine aminotransferase (ALT) level two folds higher than the upper limit of normal (ULN) range. However, many studies including ours showed that signicant inflammation and fibrosis may present in patients with chronic hepatitis B (CHB) and ALT<2×ULN, suggesting that antiviral treatment should be commenced. At present, liver biopsy is the gold standard for evaluating liver damage,yet it is an invasive and painful procedure, with rare but potential life-threatening complications, limiting its application. New biomarkers which can predict the overall histological severity of liver in CHB patients with ALT<2×ULN are therefore of great importance. We recently analyzed the metabolomic profile of CHB and found four potential serum biomarkers. In the present study, we will develop multivariate models using Liquid chromatography coupled to mass spectrometry（LC/MS）technology providing high metabolomics coverage to differentiate samples from CHB cohort with ALT <2×ULN, and normal health cohort.Based on this model, we will further identify and validate the serum metabolite markers for predicting antiviral treatment in CHB patients with ALT <2×ULN . We will also explore the gene function research based on the metabolic pathways of biomarker in vitro. In summary, this study aims to discover certain non-invasive biomarkers to predict antiviral treatment of CHB with ALT<2×ULN, and to further explore the underlying mechanisms.

多个指南推荐慢乙肝患者ALT≥2×ULN或存在显著肝脏病理改变时需抗病毒治疗。多个研究，包括我们的前期结果显示部分ALT<2×ULN的慢乙肝已存在显著肝脏病理改变。因肝活检是有创检查，限制了该部分患者的早期检出。因此发现能有效反映肝脏病理状态的无创生物标志物，对指导抗病毒治疗有重要的意义。我们前期研究发现不同肝脏病理状态的ALT<2×ULN的慢乙肝各有特异的血清代谢谱，并从中鉴定出4种较特异的代谢物，提示血清代谢物具有成为无创生物标志物的潜能。在此基础上，课题组拟进一步采用基于液相色谱-质谱的代谢组学方法，结合模式识别技术，筛选生物标志物；进而通过临床标本和HBV转基因小鼠体内实验研究验证已入选代谢物的早期诊断价值；最后通过体外实验对标志物代谢通路进行功能研究以阐述发病机制。本课题旨在为 ALT<2×ULN的慢乙肝提供有效的生物标志物，指导临床早期抗病毒治疗，为慢乙肝发病机制提供理论基础。

寻找能有效反映肝脏病理状态的无创生物标志物或建立无创预测模型，对指导抗病毒治疗具有重要的意义。本课题组通过临床回顾性分析、代谢物组学、蛋白质组学及体外实验等进行抗病毒标志物的筛选、肝纤维化分子机制的研究及功能学研究，对寻找合适的生物标志物或建立无创模型进行了探索。首先通过临床回顾性分析研究，发现AST、Anti-HBC和GGT是抗病毒治疗的独立预测因子，其联合指标构建的无创模型具有良好的诊断性能。对显著病理改变组(需抗病毒治疗)和无显著病理改变组慢乙肝患者血清进行LC/MS的代谢组学分析，并应用模式识别技术（PLS-DA）统计分析，显示血清代谢物组学技术能较好的区分显著病理改变组和无显著病理改变组，通过多级质谱和精确分子量、结合代谢相关性网络、数据库检索分析推断等鉴定出21种代谢物，对这21种代谢物通过ROC曲线及线性回归分析显示磷脂酰肌醇PI(P-16:0/17:2)、磷脂酰丝氨酸PS(P-18:0/20:4)具有较高的诊断价值，可能作为抗病毒标志物。对轻度（S0-1）、中度(S2)和重度(S3-4)肝纤维化患者血清采用iTRAQ技术进行蛋白质组学分析，发现IGF1、FCN2、CPB2、FGL-1和PAI-1蛋白可能是S2期的特异性诊断标志物。进一步ELISA分析轻度（S0-1）、中度(S2)和重度(S3-4)肝纤维化血清中的这5种蛋白，发现FCN2和CPB2蛋白在中度肝纤维化（S2期）患者血清中水平与健康人和其他不同分期患者有显著差异，可作为候选的S2期的特异诊断标志物。对轻中度（S0-2）和重度(S3-4) 乙肝肝纤维化血清进行GC-MS代谢物组学分析，并联合多元统计，筛选出包括α-KG等12种代谢物，采用联合ROC曲线分析表明，其对于区分肝纤维化轻中度（S0-2）和重度(S3-4)的诊断效能优于传统血清学指标APRI和FIB-4。MetaboAnalyst 2.0分析表明，乙肝肝纤维化显著改变的代谢途径包括亚油酸代谢、三羧酸(TCA)循环和花生四烯酸代谢，而大多数代谢物的代谢途径都围绕α-KG。进一步研究了关键代谢产物α-KG在乙肝肝纤维化进展中的作用。研究表明α-KG可促进HSC中P300的表达和活性，而P300通过结合smad2/3促进其进入细胞核，导致α-SMA和I型胶原的表达，从而揭示了HSC激活的新机制。