mRNA 7mG帽子结构在哺乳动物节律调控中的作用

Circadian rhythm is endogenous 24~hour oscillation which serves as a basis for organisms to navigate responses to dynamic environmental conditions. The transcriptomic profiling has revealed thousands of rhythmic expressed genes, and most rhythmic mRNAs may be regulated in post-transcriptional manners. The 5’ end of matured RNA in eukaryotes was post-transcriptionally modified as m7GPPPN cap structure, which participates in a series of post-transcriptional regulatory processes, including pre-mRNA processing, RNA stability, RNA transport, and initiation of translation. In previous studies, we found that Rnmt, which involved in synthesis the cap, and Nudt16, which involved in the degradation of the cap, show rhythmic expression in circadian rhythm. Therefore, we hypothesize that the level of mRNA cap could also oscillate in circadian rhythm and regulate a series of rhythmically expressed genes. In this study, we intend to investigate the dynamic changes of the level of mRNA 5’ end cap in the circadian rhythm by using Cap-seq, and identify rhythmically expressed genes regulated by the 5’ end cap. We would further investigate the potential role of Rnmt and Nudt16 gene in regulating mammalian circadian rhythm, and identify their downstream genes. The study would provide fundamental insight into post-transcriptional regulation of rhythmic expression genes by the cap stracture of RNA.

昼夜节律是生物适应外部环境变化而进化出的一种24小时的周期性生理现象。虽然全转录组分析鉴定了几千个节律表达基因，但其中80%节律表达的mRNA受转录后水平调控。RNA 5’端7mG帽子结构是真核生物转录后修饰形成的m7GPPPN结构，其参与了一系列转录后调控过程。我们前期研究发现，参与RNA 7mG帽子结构合成的基因Rnmt及7mG帽子结构降解的基因Nudt16，其mRNA水平呈24小时节律变化，而其对应的新生RNA水平却并未呈节律变化。据此，我们推测mRNA 7mG帽子结构的水平可能以转录后调控的方式调节了一系列基因mRNA的节律表达。本项目拟改进现有的Cap-seq测序技术，并在全转录组范围鉴定mRNA7mG帽子结构水平呈节律变化的基因。此外，我们将运用基因敲除小鼠研究Rnmt和Nudt16对小鼠节律行为和下游基因表达的影响，为揭示mRNA 7mG帽子结构参与的节律调控机制奠定基础。

RNA加帽是一个复杂的生物学过程，它通过5’-5’三磷酸键在新生RNA的第一个核苷酸反向连接上一个未甲基化的鸟苷，并在RNMT与RAM的作用下进行甲基化修饰，生成Cap0结构。为了能够精确定量不同加帽状态的RNA，我们结合免疫与化学方法的优势，改进了以往的帽子捕获方法，建立了针对Cap 0结构RNA(m7G-capped)高通量测序方法Cap-capture-seq(CapC-seq)。通过CapC-seq，可实现了同时对细胞内不同RNA分子Non-capped, G-capped与m7G-capped状态的定量。此外，CapC-seq显示出了m7G-capped RNA具有很高的TSS富集程度，对于7mG帽子结构的高特异性捕获。同时，我们发现核心节律基因的表达在m7G-Cap和no-Cap结构中存在差异。我们还构建了Rnmt敲除小鼠，研究了帽子结构异常可能影响的生理和行为过程及其潜在的机制。我们发现帽子结构异常可影响机体代谢和行为表型。Rnmt杂合小鼠中加帽功能下降，加帽 (Capping) 相关的基因以及与去帽 (Decapping) 相关的基因均有显著下降。帽子结构在mRNA前体的剪接过程发挥重要作用。帽子结构异常可影响多个RNA结合蛋白，使核糖核蛋白复合物生物发生显著下调。CapC-seq作为一种帽子捕获技术，借助其能够区分不同加帽类型RNA的特点，对于RNA动态表达的研究，特别是昼夜节律提供了一种精确且强有力的方法。