一个新的编码水稻PHD锌指蛋白雄性不育基因MMS1的发现与功能解析

The breeding of male sterility line is an important step in crops heterosis utility. At same time, the studies of cloning and function of new gene of male sterility are better way to understand the formation and development of gamete in the sexual propagation plant. In previous study, we gained a MS mutant with no pollen and located the gene to the range of 15kb in short arm of Chr.8 by mapping cloning. Finally, we cloned the gene and found that it is a new gene,which encode 698 a.a unknown protein in rice. In order to know about the behavior of chromosome and microstructure of anther in mutant, the male gametophyte at different stages will be observed by tissue compression method and semi-thin sectioning. The sub-cell location of new gene will be study by GFP instantaneous expression technology. The web of interacted and regulation pathway will be analyzed through RNA-seq. Appling the yeast two-hybrid system find the interaction protein with MMS1. Lastly, the evolutional position of the new gene will be evaluated by biological informatics. The biological function will be tested by transgenic method, which will construct the RNAi vector. This study will uncover the molecular mechanism of development in rice pollen, seeing as a research bases of new breeding system and crops heterosis utility by artificial oriental mutant or male sterility materials.

雄性不育基因的克隆及功能解析是研究有性生殖生物配子体形成与发育分子机理的有效途径，同时，雄性不育系的研制也是农作物杂种优势利用的重要手段。本项目前期研究工作中，获得了一无花粉型水稻雄性不育突变体，通过配置其分离群体，借助图位克隆方法已完成该基因的定位和克隆，发现其编码698个氨基酸功能未知蛋白。本项目拟对MMS1控制雄配子体发育的机理进行深入研究，通过观察其雄配子发育的各时期组织切片和染色体行为，明晰雄配子体形态发育的显微结构和染色体动态变化；利用GFP瞬时表达技术研究MMS1蛋白在亚细胞水平定位情况；借助二代测序技术从转录组水平解析与其他雄性不育基因的关系和调控网络；运用酵母双杂交技术筛选与MMS的相互作用的蛋白，寻找下游调控蛋白,揭示MMS1在水稻雄配子体发育过程中的时空表达和调控网络，并为利用雄性不育材料进行杂种优势育种奠定理论基础。

水稻是最重要的粮食作物，养活了地球上近一半的人口。随着全球人口的不断增加，粮食安全将会变成一个越来越严重的全球性问题。单纯通过扩大种植面积来增加水稻总产量已不可能，因而提高水稻产量成为迫在眉睫的问题。. 寻求新的雄性不育种质资源对提高杂交水稻育种技术起着重要作用；同时对其水稻雄配子体发育分子机制的深入研究有助于定向人工突变创制新的不育种质资源以及新的育种体系提供理论基础。水稻中广泛存在的核雄性不育材料，不育性遗传性状稳定，受外界环境条件影响小。加深对有性生殖植物雄配子体形态发育与调控的分子机制的理解，将在拓宽水稻种质资源、增加优良组合的自由度、充分利用杂交优势、简化育种程序等方面有着重要意义。. 本项目组致力于雄性不育材料的鉴定及基因功能研究，针对发现的不育型的突变体，配制定位群体，将基因定位到8号染色体MMD1附近，通过测序验证了水稻MMD1的突变类型，完成了突变体花药及小孢子发育情况细胞学观察及染色体行为观察。同时，明确了突变体材料观察不到花粉母细胞膨大和紧接着进行的一次有丝分裂，不能形成二粉花粉，绒毡层向内部溶解，弥散整个药室，随后整个花药凋亡、干瘪，最终没有观察到成熟花粉；明确了突变体材料终变期染色体形态一直维持，少数细胞能够继续向下一个时期进行；完成了突变体MMD1基因的各组织表达模式及RNA转录组测序。然而，该基因基因编辑的结果证实了该基因的突变不影响小孢子的发育；构建了不同长度MMD1基因截短的酵母双杂载体，证实与减数分裂相关基因不存相互作用。进而，通过高通量重测序发现了新的突变位点，通过新突变位置附近10个位点的基因编辑个体验证了S3-1到S7-1位点的基因编辑材料小孢子表现出不育表型。.本项目通过组织结构学、细胞生物学、遗传学等一系列生物学研究方法，验证了OsMMD1不影响水稻小孢子减数分裂及后期发育，寻找到了一个新的不育基因位点，验证了其生物学功能，为人工利用雄性不育基因奠定理论基础。