一个新的水稻PPR蛋白编码基因OsSAL的克隆与功能分析

The PPR protein family is one of the largest protein families in land plants, which is involved in RNA splicing, RNA editing, RNA degradation and RNA translation in chloroplast and mitochondria. We obtained a seedling albino lethality mutant ossal in the tissue culture of japonica rice cultivar Zhonghua 11. Leaves in ossal contained abnormal chloroplast which had degenerated thylakoids and grana lamella stacks and more osmiophilic granules when compared with that in wild type. Using map-based cloning, OsSAL was mapped on chromosome 7 and sequencing results showed that the coding region of OsSAL in ossal has a 13 bp deletion, causing a premature stop codon. OsSAL encodes a pentatricopeptide repeat (PPR) protein containing a DYW-like domain, which indicates that OsSAL may be involved in C-U RNA editing in chloroplast. In order to further clarify the chloroplast development mechanism and explore the potential enhancement of photosynthesis in rice which OsSAL is involved in, this project will mainly construct complementation experiment analysis, expression pattern analysis, RNA editing site analysis and protein interaction analysis.

PPR蛋白家族是陆生植物中最大的蛋白家族之一，其参与了叶绿体和线粒体RNA的拼接、编辑、降解以及翻译。在组培过程中，我们从粳稻品种中花11的后代中发现了一个苗期白化致死的突变体ossal（seedling albino lethality）。与野生型相比，ossal叶片的叶绿体结构异常，类囊体和基粒片层结构退化，嗜锇体含量较多。利用图位克隆的方法，我们已将OsSAL基因定位在第7染色体上，测序发现突变体的OsSAL基因编码区发生13 bp的缺失，导致提前产生终止密码子。OsSAL基因编码一个含有类似于DYW结构域的PPR蛋白，表明其可能参与了水稻叶绿体RNA的C-U编辑。为进一步剖析OsSAL基因参与的叶绿体发育机制，探讨其提高水稻光合作用的潜力，本项目将主要开展OsSAL基因的互补分析、基因表达模式分析、RNA编辑位点分析以及互作蛋白分析。

在陆生植物中，叶绿体转录本大多需要进行转录后修饰（包括剪切拼接、编辑、修剪等），才能被翻译为蛋白质，这一关键步骤需要一系列核编码的蛋白质的参与。在本研究中，我们从粳稻品种中花11的组培后代中分离得到了一个白化突变体sla4，该突变体从种子发芽开始到3叶期均表现为白化表型，并在3叶期时逐渐枯萎死亡。sla4突变体缺乏正常的光合色素，其光合作用也严重受损，且其叶片早期叶绿体发育严重受损。图位克隆结果显示，sla4突变体第7染色体的OsSLA4基因产生13bp缺失，导致提前产生终止密码子。利用CRISPR/Cas9系统敲除野生型中花11的OsSLA4基因同样得到白化植株。OsSLA4基因编码一个定位于叶绿体的PPR（pentatricopeptide repeat）蛋白，其包含15个PPR结构域和1个非典型的类DYW结构域。OsSLA4蛋白的缺失导致了sla4突变体叶绿体基因atpF、ndhA、petB、rpl2、rpl16、rps12-2和trnG的II类内含子不能正常剪切拼接，同时也导致了sla4突变体叶绿体核糖体RNA的转录表达严重减低，也影响了sla4突变体一些叶绿体发育和光合相关基因的转录表达。上述研究结果表明，OsSLA4蛋白通过影响水稻多个叶绿体基因II类内含子的剪切拼接，进而影响水稻叶片早期叶绿体发育和苗期生长。为进一步阐明水稻中不同RNA加工因子的功能，我们利用CRISPR/Cas9系统敲除了野生型中花11的30个PPR基因、7个RIP/MORF基因、2个ORRM基因和4个OZ基因，并获得了各基因的敲除突变体。这些新的突变体的获得将有助于阐明RNA加工因子在水稻RNA加工过程所扮演的功能角色。