草菇CRISPR/Cas9基因功能鉴定技术研究

Genome sequencing technology has become increasingly mature, and the cost has been greatly reduced. Genome sequencing will become a basic data platform of molecular biology research in edible fungi. Ten genomes of edible fungi have been completely sequenced. Although several laboratories have devoted themselves to the research on gene knockout and RNAi, there was not big breakout in the research of funtional genomics of edble fungi for their poor efficiency .In this proposal,we aim to create a technology platform for functional gene identification of mushroom using the third generational endonucleases system - CRISPR/Cas9 which was built in 2013. This system is also expected to provide technology and method for functional genomics research of edible fungi.

基因组测序技术已趋成熟，并且测序费用已大幅度降低，基因组测序将成为食用菌分子生物学研究的基础数据平台。目前已有10种食用菌完成了基因组测序，虽然有多个实验室在开展基因敲除、RNA干扰研究，但由于食用菌的基因被敲除和干扰的效率低，这么多年了食用菌功能基因组研究未见突破性进展。本研究拟采用2013年初建立起来的第三代人工核酸内切酶CRISPR/Cas9系统来建立食用菌基因功能鉴定技术平台，为食用菌的功能基因组研究提供技术与方法。

第三代人工核酸内切酶CRISPR/Cas9系统是2013年初建立起来的，这一技术广泛应用于基因的功能鉴定，并且开始应用于品种的定向改造。草菇的基因组测序已完成，这一技术如果能用于草菇的基因功能鉴定，将大大提高草菇的研究水平。主要研究内容包括载体构建、CRISPR/Cas9 介导基因定点 Indel 的策略研究、CRISPR/Cas9 介导基因定点 Indel 的遗传效应。主要结果：① 本项目克隆了草菇γ淀粉酶基因（γ-Amy1和γ-Amy2），这两个γ淀粉酶基因都存在大量的gRNA序列，这是开展CRISPR研究面临着选择哪个序列作为gRNA的问题，研究发现不同的gRNA的脱靶指数差异很大。检测gRNA的脱靶指数需要有基因组数据，这意味着将来开展食用菌的CRISPR研究需要有基因组数据作为支撑，否则无法对gRNA进行优选，如果随机选取一个gRNA进行CRISPR基因编辑，可能会产生大量的非期望效应。② SSA检测DSBs，虽然曾用于ZFN、TALEN的基因编辑效率检测，还没有报道用于CRISPR技术中的gRNA筛选，本项目应用SSA原理，并结合生物荧光技术，建立了gRNA编辑效率的检测技术，试验结果也表明不同的gRNA序列显著影响基因的编辑效率。这一方法将有助于提高食用菌CRISPR基因编辑的效率。