牛流行热病毒候选受体的鉴定及其与病毒蛋白结合位点分析

Bovine ephemeral fever (BEF) is an acute febrile infection of cattle caused by bovine ephemeral fever virus of the Rhabdoviridae family and leads to severe economic losses to the cattle industry. The first step in rhabdoviruses infection requires the interaction between viral envelope glycoprotein G and cellular receptors. However, BEFV receptors are still unknown. Our previous studies have shown that five host cell membrane proteins could interact with BEFV G. In this study, BEFV putative receptors will be further identified by co-immunoprecipitation on the basis of host cell membrane proteins. The capability of virus binding and infection to sensive cells will change or not via silencing the putative receptor gene of sensive cells is used to further verify whether it is BEFV receptor. Infection experiment is used to further determine the role of BEFV putative receptor after expression of the gene on non-sensitive cells. Immunofluorescence localization of the virus and its receptors on the cell surface will be investigated if they could combine, and study the binding site by using gene fragmentation, site-specific mutagenesis and GST Pull-down technology.The study will find BEFV receptors and their binding sites between viral protein and receptors, which clarifys the mechanism of viral infection and lays the foundation for the development of antiviral drug.

牛流行热（BEF）是由弹状病毒科的牛流行热病毒（BEFV）引起的急性、热性传染病，给养牛业造成严重的经济损失。尽管弹状病毒主要是通过病毒G蛋白识别病毒受体而感染宿主细胞，但是目前BEFV的受体尚不清楚。我们已初步筛选出可与BEFV G蛋白结合的细胞膜蛋白5种，本研究拟在此基础上利用免疫共沉淀技术进一步验证BEFV G蛋白结合的病毒候选受体；沉默易感细胞上病毒候选受体基因，检测易感细胞是否对病毒感染有抗性，进而发现病毒受体基因；在病毒非敏感细胞上表达该基因，检测非敏感细胞是否对病毒感染变得易感，进而验证其在病毒感染过程中的作用；应用免疫荧光技术对BEFV G蛋白与病毒受体在细胞膜上的分布进行定位，分析两者作用的时空可能性；运用基因分段截短、突变并结合GST Pull-down技术确定病毒与受体的结合位点。本研究将发现BEFV受体及其与病毒结合位点，为阐明病毒感染机制及研制抗病毒制剂奠定基础。

牛流行热是由弹状病毒科的牛流行热病毒(Bovine Ephemeral Fever Virus，BEFV)引起的牛的急性、热性传染病，该病传播速度快、传染性强，给养牛业造成巨大的经济损失，是我国重点防控的牛疫病之一。病毒受体在特异性地介导病毒与细胞的结合、病毒的侵入方面发挥关键作用，弹状病毒主要是通过病毒G蛋白识别病毒受体而感染宿主细胞。本研究利用噬菌体肽库技术筛选出可与BEFV G蛋白结合的小分子多肽，通过比对分析包含多肽同源基序的细胞膜候选受体分子蛋白，在此基础上利用Pull down技术、免疫共沉淀技术进一步验证了BEFV G蛋白可与ANX-A2结合；应用免疫荧光技术观察BEFV G蛋白与ANX-A2可在细胞膜上进行定位。过表达ANX-A2基因，可促进BEFV的复制，相反，应用siRNA 沉默ANX-A2后可相应地抑制BEFV的增殖，验证了ANX-A2基因在BEFV感染过程中发挥重要的作用。同时，ANX-A2单克隆抗体竞争对BEFV感染BHK-21细胞具有一定的阻断作用。在病毒非敏感细胞上过表达ANX-A2，感染BEFV，与对照相比，BEFV可吸附进入非敏感细胞，进一步证实了ANX-A2可能在BEFV感染过程中发挥受体的功能。运用基因分段截短并结合GST Pull-down技术确定ANX-A2与病毒G蛋白结合的位点，初步检测到ANX-A2 C末端可与BEFV G1蛋白结合。本研究主要对BEFV感染的候选受体进行了相关验证，初步揭示病毒感染机制，为研制抗病毒制剂奠定基础，也为其他病毒受体的研究提供技术平台。发表论文6篇，其中SCI论文4篇，授权的国家发明专利1项，出版著作1部。